高效液相色谱法检测枯草芽孢杆菌发酵液中乙偶姻和2,3丁二醇含量

毛林静,孟 武,王 莹,王婧臻,王 慧,楚 杰,*

(1.山东农业大学动物科技学院,山东泰安 271018;2.齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所,山东济南 250014;3.齐鲁工业大学(山东省科学院)生物基材料与绿色造纸国家重点实验室,山东济南 250353)

乙偶姻,又名3-羟基丁酮,具有特殊的奶油香味,是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料,是国际上常用的香料品种,主要用作奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料的生产,也是酒类调香中一个极其重要的品种,国家标准GB 2760-86规定其为允许使用的食品香料[1]。同时,乙偶姻也广泛应用于医药领域[2]、化妆品[3]、化工产品[4]和植物生长促进剂及植物病虫害生物防治等农业领域[5]。2,3-丁二醇作为乙偶姻的还原产物[6],亦是一种重要的化工原料,常作为能源、航天航空[7]、橡胶树脂制造[8]等。

目前,国际市场上的乙偶姻香料和2,3-丁二醇产品主要由美国、德国和日本的几家大公司生产,并且主要为合成产品。然而合成法存在产品收率和得率较低,且环境污染较严重等缺点。而微生物发酵法具有环境友好、反应条件温和等特点,越来越受人们关注。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)具有易培养、繁殖快、易保存、对环境适应强、无毒无污染等特点,可以生产高浓度的乙偶姻,并且菌株具有生物安全性,非常适合乙偶姻的生产。但枯草芽孢杆菌发酵过程中,在代谢产生乙偶姻的同时,也产生2,3-丁二醇,两者存在可逆性,所以发酵过程中同时检测这两种物质的变化对高产乙偶姻的调控尤其重要。

目前关于国内外采用高效液相色谱法检测乙偶姻的文献报道较多,杨宇霞等[9]采用高效液相色谱法成功检测出山西老陈醋中乙偶姻的含量,且证实该方法稳定高效精确度高。余书奇等[10]利用2,4-二硝基苯肼衍生-高效液相色谱法,采用紫外检测器检测葡萄酒中的乙偶姻,精确度高但方法复杂。汤丹丹等[11]采用高效液相色谱法检测乙偶姻和四甲基毗嗪,并证实两者之间呈正相关。张少飞等[12]建立了高效液相色谱法单独测定山西老陈醋中的川芎嗪的方法。有报道采用溶剂提取食醋中的乙偶姻后直接经紫外光谱检测[13],由于乙偶姻在紫外吸收处无特异性,干扰大,从而影响其回收率。但是,对于同时检测乙偶姻和2,3-当二醇的文献未见报道。

本文建立了使用高效液相色谱仪同时检测乙偶姻和2,3-丁二醇的方法,以快速准确检测枯草芽孢杆菌发酵液中二者含量,为后续枯草芽孢杆菌发酵调控生产高产乙偶姻提供方法依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枯草芽孢杆菌BS168 实验室保藏;乙偶姻标准品(CAS号为513-80-6) 纯度为99%,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;2,3-丁二醇标准品(CAS号为513-85-9) 纯度为98%,国药集团化学试剂有限公司;LB肉汤培养基、LB固体培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司;甲醇、乙腈(色谱级) 赛默飞世尔科技有限公司。

Waters高效液相色谱仪(带示差折光检测器) 捷岛分析仪器有限公司;反向C18分析柱 上海汉尧仪器设备有限公司;真空抽滤机 天津恒奥科技有限公司;Bio-Rad Aminex HPX-87H糖分析色谱柱 美国伯乐;TGL-16G离心机 上海安亭科学仪器厂;Molecular摩勒分析型超纯水机 上海摩勒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品前处理 以超纯水(0.22 μm水系微孔滤膜过滤)为溶剂配制乙偶姻和2,3-丁二醇标准品浓度梯度分别为:50、40、30、20、10、5、2.5、1.25、0.625 g/L。

1.2.2 枯草芽孢杆菌发酵液的制备

1.2.2.1 种子活化 无菌条件下从LB固体斜面培养基中刮保藏的枯草芽孢杆菌取一环枯草芽孢杆菌菌体于50 mL LB肉汤培养基中,摇床37 ℃,180 r/min培养12 h。活化后按3%接种量接种于100 mL LB肉汤培养基中同样条件继续培养14 h作为种子液。

1.2.2.2 发酵培养条件 发酵培养基配方为:葡萄糖81.58 g,酵母浸粉10 g,尿素5.77 g,K2HPO410 g,玉米浆干粉5 g,MgSO41 g,MnSO40.08 g,纯净水1000 mL,pH=6.5。按3%接种量接种于装有200 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中,摇床37 ℃、180 r/min发酵培养。

1.2.2.3 发酵液处理 取3 mL发酵液于5 mL离心管中,12000 r/min离心5 min,取上清,0.22 μm水系微孔滤膜过滤,装入样品瓶,4 ℃保存备用。

1.2.3 色谱柱选择 以标准品出峰时间及峰高为指标,选用不同浓度梯度的标准品溶液作为待测物,流动相均采用色谱级有机溶剂。分别选取反向C18柱,示差检测器,流动相分别为a.甲醇∶水(0.05%三氟乙酸)=90∶10、50∶50;b.乙腈∶水=90∶10、50∶50。进样量10 μL,流速0.8 mL/min。Bio-Rad Aminex HPX-87H柱,选择流动相为:0.005 mol/L的硫酸溶液。进样量10 μL,流速0.5 mL/min。

1.2.4 线性范围、相关系数及检出限 准确配制乙偶姻和2,3-丁二醇标准品,浓度梯度分别为50、40、30、20、10、5、2.5、1.25、0.625 g/L;色谱条件采用流动相为0.005 mol/L的硫酸溶液(0.22 μm滤膜过滤),流速0.5 mL/min,分析柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm),示差检测器,柱温28 ℃进行检测。

1.2.5 稳定性试验 将乙偶姻和2,3-丁二醇标准品分别放置2、4、6、8、10 h,基于以上色谱条件检测色谱峰面积[14]。

1.2.6 精密度试验 将乙偶姻和2,3-丁二醇同一浓度的标准样品在色谱条件下连续进样检测6次,对峰面积进行测定。

1.2.7 加标回收率测定试验 取发酵48 h的发酵液,采用样品加标的方法计算回收率。

回收率(%)=(C1-C2)/C3×100[15]。其中C1表示添加标准样品后样品的检测质量浓度(mg/mL);C2表示未添加标准样品时的检测质量浓度(mg/mL);C3表示标准品的添加量(mg/mL)。

1.3 数据处理

试验结果均采用平均值±标准偏差表示,数据采用SPSS 20.0软件对结果单因子方差分析,P>0.05说明处理组之间差异不显著。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的确定

2.1.1 反向C18分析柱 采用反向C18柱检测,混合标准品色谱图分别如图1所示。

图1 不同洗脱条件下乙偶姻和2.3-丁二醇色谱峰图

由图1可知,当色谱柱选取反向C18柱时,流动相选取乙腈-水或甲醇-水,流动相选取不同比例,混合标准品出峰时间一致且样品峰与流动相峰重叠,不易分析与分离。查阅资料可知反向C18分析柱固定相的极性小于流动相的极性,乙偶姻和2,3-丁二醇标准品皆为纯水溶解制备,极性大于流动相极性,故不宜使用此分析柱标准品混合物。

2.1.2 Bio-Rad Aminex HPX-87H糖分析色谱柱 色谱柱选取Bio-Rad Aminex HPX-87H糖分析色谱柱,流动相选取0.005 mol/L的硫酸溶液(0.22 μm滤膜过滤),流速0.5 mL/min,由于2,3-丁二醇在紫外无吸收峰[16],故采用示差检测器。测得色谱图如图2所示。

图2 乙偶姻、2,3-丁二醇混合标品色谱图

由图2可以看出,当选择Bio-Rad Aminex HPX-87H 糖分析色谱柱时,选取流动相为0.005 mol/L的硫酸溶液,乙偶姻和2,3-丁二醇混合标准品出峰时间相差1 min,且峰形完好,乙偶姻出峰保留时间为21.646 min,2,3-丁二醇出峰保留时间为20.216 min。

最终确定色谱条件为如下:色谱分析柱:Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm),pH范围1～3;流动相:5 mmol/L H2SO4溶液=100%;进样量:10 μL;流速:0.500 mL/min;柱温箱:28 ℃;色谱柱温:28 ℃;压力:754±20 bar。

2.2 线性回归方程及相关系数、检出限

按照1.2.4方法进行线性回归方程制作试验,结果如表1所示,由表1可知,以乙偶姻和2,3-丁二醇的峰面积(Y)对相应的质量浓度(X)进行线性回归,仪器检出限分别为0.1和0.3125 mg/mL。以乙偶姻和2,3-丁二醇的峰面积(Y)对相应的质量浓度(X)进行线性回归[17],乙偶姻和2,3-丁二醇相关系数分别为0.9997和0.9998,说明乙偶姻、2,3-丁二醇的浓度与峰面积有良好的线性关系,符合定量分析要求[18]。

表1 线性方程、相关系数及检出限

2.3 稳定性试验

根据方法1.2.5进行标准品稳定性试验,结果见表2、表3,乙偶姻和2,3-丁二醇目标浓度为50 g/L。结果表明,相对标准方差RSD分别为1.2%和1.6%,均≤2%,说明标准品在10 h内稳定[19]。

表2 乙偶姻标准品稳定性试验

表3 2,3-丁二醇标准品稳定性试验

2.4 精密度试验

按照方法1.2.6进行检测方法的精密度试验,结果见表4,由表可知,乙偶姻和2,3-丁二醇浓度的相对标准偏差分别为1.76%和1.74%,《中国药品检验标准操作规范2010年版》规定,高效液相色谱法的精确度相对标准偏差≤2%。表明方法精密度较好[20]。

表4 精密度检验

2.5 加标回收率试验

根据方法1.2.7进行加标回收率测定试验,发酵液加标色谱图见图3、表5。从表5可以看出,乙偶姻、2,3-丁二醇的加标回收率在98.93%～102.10%之间,方法准确性较高,适合于枯草芽孢杆菌发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇的检测分析。

表5 加标回收率试验

2.6 高效液相色谱检测不同时间段发酵液中的乙偶姻和2,3-丁二醇

采用上述试验得出色谱条件检测发酵液样品,每个样品设三个平行,分别在24、48、72、96、120 h取样检测发酵产物生成量并测pH,各个时间段不同乙偶姻及2,3-丁二醇含量含量见表6。

表6 不同时间段乙偶姻产量

由表6不同时间段发酵液中乙偶姻和2,3丁二醇含量变化趋势可知,发酵前期,碳源和溶氧量充足,枯草芽孢杆菌利用葡萄糖一方面大量繁殖,一方面代谢合成产物乙偶姻。据文献报道,高溶氧有利于乙偶姻的生成,较低的溶氧条件利于2,3-丁二醇的产生[21]。发酵后期,菌体量增加,培养基中溶氧、碳源含量下降,乙偶姻一部分作为碳源被菌体利用[22],一部分转化为2,3-丁二醇[23]。在发酵初期至72 h,乙偶姻含量逐渐增加,72 h达到最大产量25.24 g/L。72 h之后,2,3-丁二醇呈迅速增加趋势,120 h时含量达到23.73 g/L,而乙偶姻作为碳源被代谢利用而下降。乙偶姻含量在72 h最高,之后下降,说明当培养后期葡萄糖耗尽时,抑制消失,乙偶姻作为后续能源和碳源被细胞利用以保持细胞活性[24]。发酵后期pH稳定在6.5,菌体量下降不明显。

3 结论

本文建立采用高效液相色谱法(示差折光检测器)检测枯草芽孢杆菌发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇的方法,发酵液前处理简单易操作,检测方法方便快捷、准确性、精密度高,色谱条件为流动相为0.005 mol/L的硫酸溶液(0.22 μm滤膜过滤),流速0.5 mL/min,分析柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm),示差检测器,柱温28 ℃进行检测。其回收率在98.93%～102.10%,相对标准偏差为≤2%。该方法适合于整个发酵过程中发酵条件的优化以及发酵产物的实时监测[25],故可作为枯草芽孢杆菌发酵液中乙偶姻、2,3-丁二醇代谢调控的参考方法,为枯草芽孢杆菌在发酵过程中产乙偶姻和2,3-丁二醇的含量变化及调控发酵产物产量作监测依据。