翠云草挥发油成分分析、抗氧化及抗菌效果

雷 杰,黎维维,欧阳陈琳,马先奎,王 刚

(遵义医科大学药学院,贵州遵义 563000)

翠云草(Selaginellauncinata),又名龙须、蓝草、剑柏,是卷柏科卷柏属多年生草本植物[1-2]。翠云草具有清热解毒、化痰止咳、清热利尿、利水消肿之功效。临床上多用于治疗急性黄疸型传染性肝炎,胆囊炎,肠炎,痢疾,肾炎水肿,泌尿系感染,肺结核咯血等症[3-4]。

关于翠云草的研究现主要集中于化学成分和生物活性方面。伍晓群等[5]采用大孔吸附树脂、Sephadex LH-20柱色谱及制备高效液相色谱等分离技术,从翠云草75%乙醇提取物中鉴定出10种化学成分,主要含高级烷烃、醇、酚类化合物等。赖红芳等[6]研究了翠云草不同提取溶剂的抗氧化活性,发现60%甲醇提取物抗氧化活性效果最好;肖凌等[7]从翠云草中分离出4个双黄酮类化合物,分别是罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚、2,3,2″,3″-四氢穗花杉双黄酮、2,3-二氢穗花杉双黄酮、2,3-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚;在抗菌活性方面,吴颖瑞等[8]发现翠云草乙醇提取物对海豚链球菌有较强的抑制作用(MIC与MBC值分别为10,17.5 mg/mL)。目前未见文献报道翠云草挥发油成分及生物活性。

本课题组以翠云草为原料,采用水蒸气蒸馏法提取其挥发油,用GC-MS分离定性,进行体外抗氧化和抗菌活性试验,旨在为翠云草这一传统中药材的综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

翠云草 购自贵州遵义中药材市场,经遵义医科大学生药学张玉金老师鉴定为真品;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 购自东京化成工业株式会社;TPTZ(2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪) 购自于北京百灵威科技有限公司;菲洛嗪 购自东京化成工业株式会社;维生素C(VC) 购自国药集团股份有限公司;EDTA(乙二胺四乙酸) 购自重庆九龙化学试剂厂;标准菌种(金黄色葡萄球菌 ATCC 25623、粪肠球菌 ATCC 29212、化脓性棒状杆菌 ATCC 6051、大肠杆菌 ATCC 25922、铜绿假单胞 ATCC 19420、普通变形杆菌 CMCC 51352) 购自于成都金盛科技有限公司;三氯化铁、无水硫酸钠、正己烷、无水乙醇、醋酸钠 均为国产分析纯,购自于贵州三力试剂公司。

HP6890/5975CGC/MS联用仪 购自美国Agilent公司;SC-3614型中草药粉碎机 购自天津市泰斯特仪器有限公司;759型紫外—可见分光光度计 购自上海箐华科技仪器有限公司;FA1004B电子分析天平 购自上海沪粤明科学仪器有限公司;98-1-B型电子恒温电热套 购自天津市泰斯特仪器有限公司;挥发油提取器 购自北京欣威尔仪器有限公司;CO2恒温培养箱 购自美国Forma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 翠云草挥发油的制备 称取100 g样品,粉碎过80目筛后在蒸馏水中浸泡2 h,在100 ℃微沸状态下用蒸馏水提取6 h,收集馏出液,再用正己烷萃取3次,合并萃取液加入无水硫酸钠干燥,再进行减压浓缩回收正己烷,得到浅黄色有特殊香气的翠云草挥发油0.52 g,得率为0.52%,重复三次提取,密封0～5 ℃下保存备用。

1.2.2 气相色谱-质谱联用仪工作条件 色谱条件[9]:HP6890/5975C GC/MS联用仪,色谱柱为ZB-5MSI 5%,Phenyl-95% Di-Methylpolysiloxane(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱,初始温度54 ℃,保持2 min,以8 ℃/min升温至126 ℃后,然后以4 ℃/min升温至226 ℃,最后以8 ℃/min升温至306 ℃,保持8 min,运行时间:54 min;汽化室温度250 ℃;载气为高纯He(99.999%);柱前压7.65 psi,载气流量1.0 mL/min,进样量1 μL,分流比20∶1,溶剂延迟时间:4.0 min。质谱条件:离子源为EI源;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;电子能量70 eV;发射电流34.6 μA;倍增器电压1482 V;接口温度280 ℃;质量范围29～500 amu。定性分析是通过HP6890/5975C化学工作站检索Wiley7Nist05质谱图库和Nist05标准质谱图库解析,要求匹配度大于80%[10],半定量分析按峰面积归一化法计算出各挥发性成分的相对百分含量。

1.2.3 抗氧化能力测定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力测定 参照文献[11]方法稍作修改,分别量取2 mL不同浓度(0.02～0.12 mg/mL)的挥发油无水乙醇稀释液与2 mL DPPH溶液(0.04 mg/mL)混合均匀,室温下避光反应30 min,在517 nm波长处测定吸光度值A1,同法测定2 mL乙醇加样液的吸光度A2,以及2 mL DPPH溶液与2 mL蒸馏水的吸光度A0,以维生素C作为对照,样品对DPPH自由基的清除率Y(%)=[1-(A1-A2)/A0]× 100。

1.2.3.2 FRAP测定 参照文献[12]方法稍作修改,精密量取25 mL 醋酸钠缓冲液(pH=3.6)、2.5 mL TPTZ溶液和2.5 mL的FeCl3溶液按(10∶1∶1)的比例混合均匀,现用现配。吸取不同浓度(0.1×10-3～0.8×10-3mmol/L)FeSO4标准溶液0.1 mL,加入3 mL FRAP溶液,再加入0.3 mL蒸馏水,混匀准确反应8 min。以蒸馏水为空白,在593 nm处测定吸光度。以FeSO4标准溶液的浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得到FeSO4标准溶液FRAP标准曲线,y=0.7865x+0.0916(R2=0.9995)。取不同浓度(0.02～0.12 mg/mL)的挥发油稀释液0.1 mL于试管中,加3 mL FRAP溶液,再加入0.3 mL蒸馏水,混匀后反应8 min,以维生素C为对照,在波长593 nm处测定吸光度。

1.2.3.3 金属离子螯合能力的测定 参照文献[11]方法稍作修改,取不同浓度(0.02～0.12 mg/mL)的挥发油稀释液1 mL于试管中,加入0.05 mL的FeCl2溶液(2 mmol/L)、2.8 mL蒸馏水和0.15 mL的菲洛嗪溶液(0.1 mmol/L),混匀后室温放置10 min,于分光光度计562 nm处测定吸光度值A1。以相同浓度的EDTA做阳性对照,以相同方法测定其金属离子螯合能力;以蒸馏水代替样品做空白对照,测定吸光度值A0。金属活性按该式计算:螯合率(%)=(A0-A1)/A0× 100。

1.2.4 抗菌能力测定

1.2.4.1 供试菌悬液和挥发油供试品溶液的制备 将试验所有菌种分别取200 μL接种于10 mL肉汤培养基中,在35 ℃下活化18 h,然后根据0.5麦氏浓度标准调整细菌浓度,置于4 ℃冰箱中备用。将制得的翠云草挥发油按照倍比稀释法,用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂,将其稀释成40、20、10、5、2.5、1.25 μL/mL 6个浓度梯度的溶液。

1.2.4.2 挥发油抑菌活性的测定 采用纸片扩散法[13]。取翠云草挥发油原油100 μL滴到直径为6.0 mm的滤纸片上,贴于用100 μL细菌悬液涂布的平板上,以纯DMSO作为对照,将其在37 ℃条件下培养24 h。由此测量抑菌圈的直径,重复3次。

1.2.4.3 挥发油的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定 参照文献[14]的步骤并稍作修改。将翠云草挥发油稀释液分别加入菌悬液,37 ℃培养12 h,观察结果,无肉眼可见的细菌沉淀所对应的浓度为最小抑菌浓度(MIC)。取MIC对应的培养液100 μL接种到肉汤培养基中,37 ℃培养24 h后,培养基上没有观察到细菌生长的浓度为最小杀菌浓度(MBC)。

1.3 数据处理

试验重复三次,试验数据采用OriginPro 8.5软件进行处理分析。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS分析

对翠云草挥发油的分析,共分离出52个峰,并通过气相色谱面积归一法计算出挥发性成分在挥发油中的相对百分含量总离子流图见图1,具体分析结果见表1。结果表明,有50种成分被鉴别出,鉴出化合物的相对含量占到总峰的98.58%,挥发油成分主要包括萜类,脂肪酸及高级脂肪烃类化合物。在已鉴定的化合物中,相对百分量在1%以上的有15种,占被检出物质总量的86.03%,其主要的化学成分包括植酮(21.40%)、角鲨烯(8.53%)、棕榈酸(6.71%)、二十八烷(6.03%)等,其中含量最高的为植酮(21.40%)。

表1 翠云草挥发油的化学组分

图1 翠云草挥发油总离子流图

续表

最近研究表明,植酮是维生素E醋酸酯的中间体,同时也是烟草烟气重要的特征香成分,具有一定的抗肿瘤活性[15-16]。角鲨烯是人体胆固醇代谢途径中一个关键的中间产物,是所有类固醇类物质的生物合成前体,具有杀菌、增强细胞的活力及免疫力、抑制癌细胞生成及防止癌细胞扩散等作用,还有较好的养颜、润肤等功效,应用于化妆品、保健食品、医药等领域[17-18];棕榈酸用作沉淀剂、化学试剂及防水剂,其生理学和药理学活性十分广泛,还具有抗肿瘤作用,作用于乳腺癌和结肠癌[19-20]。

2.2 抗氧化活性测定

2.2.1 翠云草挥发油对DPPH自由基清除能力 由图2可知,当翠云草挥发油浓度在0.02～0.12 mg/mL时,对DPPH自由基清除率不断增大,当浓度为0.12 mg/mL时,翠云草挥发油对DPPH自由基清除率为65.28%,而维生素C对DPPH自由基清除率可达80.78%,翠云草挥发油清除DPPH自由基的半数抑制浓度IC50为0.76 mg/mL,维生素C的IC50为0.44 mg/mL,两者比较,翠云草挥发油对DPPH自由基清除能力较弱于维生素C。以上结果显示,翠云草挥发油具有较好的DPPH自由基清除作用。

图2 挥发油对DPPH自由基清除率

2.2.2 翠云草挥发油的抗氧化活性 由图3可知,当翠云草挥发油浓度在0.02～0.12 mg/mL时,对铁离子的还原能力不断增大,当浓度为0.12 mg/mL时,翠云草挥发油的FRAP值为0.86 mmol/L,而维生素C的FRAP值为0.89 mmol/L,两者比较,翠云草挥发油对铁离子还原能力较弱于维生素C。以上结果显示,翠云草挥发油对铁离子具有良好的还原作用。

图3 样品溶液和对照品溶液FRAP值比较

2.2.3 翠云草挥发油对金属离子的螯合能力 由图4可知,当翠云草挥发油浓度在0.06～0.12 mg/mL时,对金属离子螯合能力不断增大,当浓度为0.12 mg/mL时,翠云草挥发油对金属离子螯合率为63.60%,而EDTA对金属离子螯合率可达68.75%,翠云草挥发油对金属离子螯合能力的半数抑制浓度EC50为0.71 mg/mL,EDTA的EC50为0.32 mg/mL,两者比较,翠云草挥发油对金属离子螯合能力较弱于EDTA。以上结果显示,翠云草挥发油具有较好的金属离子螯合能力。

图4 翠云草挥发油对金属离子的螯合作用

2.3 抗菌活性测定

通过测定翠云草挥发油对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、化脓棒状杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和变形杆菌的抑菌圈直径大小、最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),比较翠云草挥发油对这6种供试菌的抑菌效果,结果见表2。

表2 翠云草挥发油抗菌活性测试

总体而言,翠云草挥发油对革兰氏阳性菌的抑制作用优于对革兰氏阴性菌的抑制作用。其中,翠云草挥发油对粪肠球菌的抑制作用最强(抑菌圈直径为17.94 mm,MIC为5 μL/mL,MBC为10 μL/mL),其次是化脓棒状杆菌(抑菌圈直径为14.63 mm,MIC为10 μL/mL,MBC为20 μL/mL),对大肠杆菌和铜绿假单胞菌也有一定的抑制作用,但是当翠云草挥发油浓度达到最大时,金黄色葡萄球菌和变形杆菌的MIC值尚未获得,所以翠云草挥发油对这两种细菌的抑菌作用较差。

3 结论

通过以上研究可知,利用GC-MS对翠云草挥发油的化学成分进行分析,鉴定出50个组分,占总峰面积98.58%,主要化学成分为:植酮、角鲨烯、棕榈酸、二十八烷等。翠云草对DPPH自由基清除能力,铁离子还原能力及金属离子螯合作用的实验均表现出较好的效果;翠云草挥发油具有较强的抑菌活性,对粪肠球菌的抑菌作用最强,其次是化脓棒状杆菌。以上结论说明翠云草挥发油是一种有待开发的具有抗氧化和抗菌作用的天然活性物质,由于翠云草挥发油的组分种类丰富多样,其抗氧化抗菌的机理还有待进一步研究。