发酵酸鱼贮藏过程中理化与感官品质变化研究

孙颖瑛,许艳顺,夏文水,姜启兴,高 沛

(江南大学食品学院,江苏省食品安全与质量控制协同创新中心,江苏无锡 214122)

我国淡水鱼资源丰富,种类多、产量大,但是由于淡水鱼水分含量高,肌间刺多,土腥味重等问题,加工利用受到了严重制约[1]。发酵是一种传统的食品加工和保藏技术,利用发酵技术有助于解决这些问题[2]。酸鱼是我国具有地方民族特色的传统发酵鱼制品之一,以鲤鱼或草鱼为原料,经宰杀、腌制后与炒熟的谷物混合后密封发酵而成。发酵成熟的酸鱼酸香爽口、营养丰富、风味浓郁,深受消费者的喜爱[3]。近年来,关于发酵鱼制品的研究逐年增加,但现有的研究主要集中在发酵菌株的筛选、发酵工艺的改善以及对发酵过程中微生物、风味、脂质、蛋白、亚硝胺等的变化研究[4-9],目前关于发酵鱼在贮藏流通过程中的品质变化及货架期的报道甚少。

发酵鱼中具有丰富的微生物和酶,在贮藏和流通过程中会对发酵鱼中营养成分组成和感官品质产生影响,而温度是影响微生物和酶活性的重要因素之一[10-11]。市售的酸鱼产品贮藏条件多为冷藏和常温,相同贮藏条件产品的保质期也有较大的差异。明确不同贮藏条件下发酵酸鱼的品质变化特性对科学制定产品贮运条件和确定产品货架期至关重要。因此,本文以感官评价、失水率、全质构、蛋白质组成、微观结构等为主要指标评价,重点评价了发酵酸鱼在冷藏(4 ℃),室温(25 ℃)和极端温度(35 ℃)不同贮藏温度条件下的品质稳定性,旨在为提高发酵酸鱼的贮藏稳定性和科学制定产品货架期提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲤鱼、玉米粉、香辛料、调味料 均购于无锡欧尚超市(高浪店);发酵菌株 酵母菌、乳酸菌和葡萄球菌(1∶1∶1)混合,由本研究室于中国传统固态发酵鱼中分离纯化制备;真空袋 中国美吉斯;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、无水乙醇、甲苯、冰乙酸、十二烷基硫酸钠(SDS) 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

DHG-9070A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;4K-15型高速冷冻离心机 德国Sigma公司;YMX-958-10L型真空包装机 泉州亿闽信机电有限公司;单臂机型物性分析仪 英国SMS公司;4K15冷冻离心机 美国sigma公司;IKA-T10高速分散机 德国IKA集团;1150H徕卡石蜡包埋机 德国徕卡公司;PM2245徕卡手动轮转切片机 德国徕卡公司;尼康ECLIPSE Ci生物显微镜 日本尼康株式会社;SCIENTZ-10ND冻干机 宁波新芝生物科技股份有限公司;su1510扫描电子显微镜 日本日立株式会社。

1.2 发酵鱼的制备与贮藏试验

鲤鱼:鲜活鲤鱼,去鱼鳞鱼脊骨、鱼头鱼尾和内脏后,清洗,切块,沥干,按质量分数计,加入3%的食盐,2%的白砂糖,2%的香辛料,搅拌混匀,置于4 ℃腌制48 h后,于烘箱50 ℃烘4 h,烘干后鱼肉水分含量为68%～72%左右。

玉米粉:玉米粉中加入质量分数为3%的食盐,2%的白砂糖,小火炒35 min,冷却至室温,接入活化的发酵菌株,充分混合后与冷却至室温的鱼肉混合(烘干后鱼肉质量∶玉米粉质量=4∶1)。

在发酵坛底部铺上一层玉米粉后一层鱼一层玉米粉压紧,顶部铺上玉米粉后压实,加盖加水密封,置于25 ℃下发酵5周。将发酵成熟的酸鱼去除表面粘附的玉米粉后真空包装,于4、25和35 ℃贮藏,贮藏过程中定期取样分析。

1.3 分析方法

1.3.1 感官评价 发酵酸鱼的感官评价参照于美娟等[6]的分析方法。在酸鱼贮藏0、45和90 d期间对其外观、滋味、气味和口感进行感官评分分析,将酸鱼切成1 cm×1 cm×1 cm的小块,由挑选的12名(6男6女,年龄均在20～35岁之间)受过专业培训的感官评定人员组成的评定小组对样品的外观、滋味、气味和口感进行感官评定(总体可接受度为25%外观+25%滋味+25%气味+25%口感),评定标准见表1。

表1 发酵鱼感官评价标准

1.3.2 失水率 失水率测定采用如下公式:

式中:W1-贮藏前发酵鱼块的质量,g;W2-贮藏后发酵鱼块的质量,g。

1.3.3 全质构分析 将鱼肉切成1.5 cm×1 cm×1 cm的小块,通过质构仪测定发酵鱼肉的硬度、弹性、内聚性、粘着性、胶黏性和咀嚼性。测试条件:采用圆柱型测试探头p/35,测试前速度为5 mm/s,测试速度为1 mm/s,测试后速度为5 mm/s,压缩形变50%,触发力5 g,每个样品重复5次。

1.3.4 蛋白质组成 参考王蔚新[12]的方法提取发酵鱼肉中各组分蛋白。称取2 g搅碎的鱼肉,加入20 mL 0.02 mol/L的磷酸缓冲液(pH6.5),均质1 min,10000×g离心20 min,重复提取两次,合并上清液即为肌浆蛋白抽提液。剩余的沉淀部分继续加入20 mL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH6.5,含0.7 mol/L NaCl),均质1 min,10000×g离心20 min,重复提取两次,合并上清液即为肌原纤维蛋白提取液。沉淀部分重新悬浮于20 mL 5% SDS溶液,85 ℃水浴加热1 h后用自来水冷却,即为不溶性蛋白。各蛋白组分的含量采用双缩脲法测定。

1.3.5 SDS-PAGE分析 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析全蛋白[3]。准确称取2.0 g鱼肉,加入18 mL 5% SDS溶液,均质后于85 ℃水浴加热1 h后用自来水冷却,将蛋白抽提液与2×样品缓冲液等体积均匀混合,煮沸4 min后待测。浓缩胶浓度为5%,分离胶的浓度为10%,待凝固后上样。浓缩胶部分电压稳定在80 V、分离胶部分电压调节为120 V。电泳结束后,用考马斯亮蓝R250染色液染色2 h,然后用脱色液过夜脱色。

1.3.6 微观结构 微观结构参照高琪等[13]的分析方法,并进行了一些改进。选取鱼背肉,切成2 mm×5 mm×5 mm小块,用carnoy溶液(60%无水乙醇,30%甲苯,10%冰乙酸)固定24 h,无水乙醇脱水2 h,50%无水乙醇和50%无水甲苯混合溶液浸泡12 h,无水甲苯透明4 h,石蜡浸泡包埋在徕卡手动轮转切片机上制备10 μm厚的超薄切片,用毛刷将切片转移至40 ℃水浴锅中展开贴片,随后将载玻片置于70 ℃烘箱中脱蜡1 h,无水甲苯洗脱20 min,无水乙醇、50%乙醇和去离子水各洗脱10 min,使用1%伊红染色后,用生物显微镜观察(放大倍数10×10)观察拍照。

1.3.7 扫描电镜 选取鱼背部肌肉,切成3 mm×6 mm×6 mm小块,用10%戊二醛固定3 d,乙醇梯度脱水,于-50 ℃预冻12 h,冻干48 h,用金涂覆至10 nm的厚度。通过扫描电子显微镜在电压为20 kV下分别放大500和5000倍观察鱼肉组织结构特征。

1.4 数据统计分析

数据采用SPSS 25.0和Microsoft Excel 2016进行处理和分析,结果表示为“均值±标准差”。采用邓肯多重分析(Duncan multiple analysis)进行组间显著性分析,显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 贮藏温度和时间对酸鱼感官品质的影响

感官评分是发酵鱼贮藏期间重要的评价指标之一,直接影响消费者的接受性。酸鱼的感官评分结果如图1所示。由图1可知,贮藏温度越高,时间越长,则酸鱼的感官评分越低。随着贮藏温度的升高,贮藏时间的增加,从鱼肉中迁移出来的水分越多,酸鱼的外观品质和口感越差。在4 ℃贮藏90 d后酸鱼的感官品质变化较小,酸香味和口感保持较好,总体可接受度相对较高。在25 ℃贮藏45 d后总体可接受度相对较高,但是在贮藏90 d后口感评分下降较明显,鱼块表面潮湿,肉质软腻,总体可接受度降低。在35 ℃贮藏45 d时,发酵酸鱼的感官品质已经出现明显劣化,表观变差,颜色变深,肉质变软,从鱼肉中渗出水分较多。

图1 发酵酸鱼储藏过程中的感官分析比较

综上所述,从感官品质方面可知冷藏(4 ℃)是最佳的保藏方式;在贮藏过程中发酵鱼肉的外观和口感是感官劣化的主要方面,均受时间和温度影响较大。Mario等[14]和KameníK等[15]研究发现发酵香肠贮藏过程中也有相似结果,贮藏温度越高,则颜色和口感方面劣化明显,感官品质越差。

2.2 贮藏温度和时间对酸鱼物性指标的影响

2.2.1 贮藏失水率 发酵鱼在贮藏过程中的失水率如表2所示,随着贮藏时间的延长,发酵酸鱼的失水率呈上升趋势,随着贮藏温度的升高,发酵鱼的失水率增加。在整个贮藏过程中,贮藏前30 d失水率增加相对显著(P<0.05)。4、25和35 ℃贮藏90 d后的发酵鱼失水率由最初的2.72%分别增加至4.14%、6.76%和9.51%。pH是影响肌肉蛋白持水性的主要因素之一,酸性条件下蛋白变性导致持水性下降。此外,在贮藏过程中鱼肉肌肉蛋白质发生了一定程度的变性与降解,肌原纤维发生了收缩,引起可存储水分的网络空间结构变小,也会导致失水率增加[16-18]。失水率的增加引起鱼肉中水分向外迁移至包装袋中,导致酸鱼感官品质的可接受程度也随之降低。

2.2.2 质构分析 质构是评价鱼肉品质的重要指标之一,发酵鱼在贮藏过程中质构变化如表3所示。贮藏早期是硬度变化的主要阶段,低温贮藏的样品具有相对稳定的质构。在贮藏过程中,发酵鱼在4、25和35 ℃贮藏30 d后的样品硬度值分别上升至最初硬度值的1.23、1.32和1.41倍,30 d后硬度的变化趋于平缓(P>0.05),且贮藏温度越高,发酵鱼的硬度值越大。贮藏期间硬度值的增加主要与贮藏过程中水分的流失有关,温度越高则失水率越高,因此温度越高则硬度值越大。李苗云等[19]在火腿肠的贮藏过程中也有相似的研究结果。在贮藏过程中发酵鱼肉的弹性和黏聚性值的变化较小,贮藏期间所有样品的弹性值在0.44～0.67范围内,而黏聚性值在0.43～0.58范围内。与25和35 ℃贮藏的样品相比,4 ℃贮藏的样品在整个贮藏过程中具有相对稳定的咀嚼度值(P>0.05)。

表3 发酵鱼在贮藏过程中全质构的变化

2.3 贮藏温度和时间对酸鱼蛋白质的影响

2.3.1 蛋白质组成 蛋白质是鱼肉的主要组分,与发酵酸鱼品质变化密切相关。鱼肉中蛋白质可以分为肌浆蛋白(sarcoplasmic protein)、肌原纤维蛋白(myofibrillar protein)和不溶性蛋白(insoluble protein)。肌浆蛋白是水溶性蛋白,存在于肌细胞间及肌原纤维间;肌原纤维蛋白属于盐溶性蛋白,存在于肌原纤维中;而不溶性蛋白是不能溶于盐溶液和碱溶液的蛋白组分,主要包括由网状蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白组成的基质蛋白和变性蛋白[20-21]。酸鱼各蛋白组分在贮藏过程中的含量变化如表4所示。

表4 发酵鱼在贮藏过程中蛋白组成的变化

从表4可以看出,在贮藏过程中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白含量均随着贮藏时间的延长而降低,贮藏90 d后,分别下降至贮藏前样品的53.46%～69.50%和63.29%～70.16%,而不溶性蛋白含量随贮藏时间的延长而增加,90 d后增加至贮藏前样品的1.13～1.38倍。贮藏温度越高,蛋白组成变化越大,低温可以有效延缓蛋白组分的变化。不同蛋白组分含量变化,一方面可能是由于水溶性蛋白随着水分的迁移而部分渗出,另一方面酸鱼在储藏过程中pH维持在4.0左右,酸性条件下肌浆蛋白和肌原纤维蛋白发生变性和聚集,从而导致不溶性蛋白质增加[22-23]。

2.3.2 蛋白电泳 采用SDS-PAGE电泳对发酵鱼在保藏过程中的全蛋白变化进行了分析。由图2可知,贮藏时间对蛋白条带的影响较小,贮藏温度对蛋白条带的影响较大。与刚发酵成熟酸鱼的蛋白电泳条带图相比,4 ℃贮藏的样品在贮藏45和90 d后蛋白条带颜色变浅,但条带数量的变化较小;25 ℃贮藏的样品蛋白条带颜色变浅,25～37 kDa之间的条带变窄;而相对于其它组样品,35 ℃贮藏的样品在贮藏45 d后,全蛋白20～25 kDa之间、37 kDa左右、75～250 kDa之间的蛋白条带消失,25～37 kDa之间、37～75 kDa之间的蛋白条带变窄,颜色变浅。根据电泳图发现,发酵酸鱼在贮藏过程中蛋白有一定程度的降解,35 ℃蛋白降解更加剧烈,这主要与内源性组织蛋白酶和微生物蛋白酶的作用将鱼肉蛋白形成小分子肽和游离氨基酸等有关[24]。

图2 发酵酸鱼储藏过程中的全蛋白电泳图谱

2.4 贮藏温度和时间对酸鱼组织结构的影响

2.4.1 光学显微结构 组织结构是影响肉制品口感的主要因素。发酵酸鱼在贮藏过程中微观组织结构的变化如图3所示。由图可知,三种贮藏温度下发酵鱼肉的组织结构变化趋势相似。刚发酵成熟的鱼肉肌肉纤维排列致密整齐,纤维间隙少且小。随着贮藏时间的延长,肌纤维内部间隙逐渐增大,贮藏温度越高则肌纤维内部间隙越大。贮藏过程中由于蛋白质降解和酶的作用,鱼肉肌纤维和连接肌纤维的肌膜逐渐脱离,形成纤维间间隙,贮藏温度越高,单个肌纤维收缩越剧烈,肌纤维直径越小,间隙越大[25]。

图3 发酵鱼在贮藏过程中微观组织结构的变化(100×)

2.4.2 扫描电镜分析 贮藏温度对发酵鱼超微结构的影响显著,图4是发酵鱼发酵成熟和不同温度下贮藏90 d后的500×和5000×的扫描电镜图,从图中可以很直观地观察到发酵鱼贮藏90 d后肌肉纤维的变化。扫描电镜放大500倍观察,刚发酵成熟的酸鱼样品肌纤维相对紧密,裂缝相对较少,贮藏90 d后的样品贮藏温度越高肌肉裂缝间距越大。35 ℃肌肉收缩,肌膜松散,肌纤维之间的间距增大,与光学显微镜观察的结果基本一致。在放大5000倍的图像中可以观察到刚发酵完成的酸鱼样品纤维结构相对平整,4 ℃贮藏的样品次之,25和35 ℃贮藏的样品肌肉纤维断裂相对明显。贮藏过程中,发酵鱼肉中蛋白质的降解导致了肌肉组织结构变化,肌肉的肌节发生了聚合或收缩,进而加大了肌纤维间间隙,酶的作用也会降解结缔组织导致肌纤维与肌膜发生脱离,增大间隙[26-27]。

图4 发酵鱼在贮藏过程中扫描电镜图

3 结论

发酵酸鱼在4、25和35 ℃贮藏90 d,贮藏温度和时间均对发酵鱼的感官品质、物性特征、蛋白质和微观组织结构有显著的影响。贮藏温度越高,则发酵鱼的感官品质劣化越严重,贮藏过程中失水率越多,硬度越大,蛋白质降解越剧烈,微观结构变化越大。随着贮藏时间的延长,感官品质发生劣化,肌浆蛋白和肌原纤维蛋白逐渐变性聚集,不溶性蛋白逐渐增加,肌纤维间间隙不断变大,水分流失和硬度的变化主要发生在贮藏前期。低温(4 ℃)有助于保持发酵鱼产品的感官品质和质构,减少水分流失,延缓蛋白的降解和肌肉纤维结构的变化。随着贮藏时间的延长,发酵鱼的品质整体上会发生不同程度的下降,但4 ℃冷藏产品整体品质相对稳定。