正交法优化黄精多糖的提取工艺

王毅 穆麒麟 田小海

摘要：以恩施市药用经济植物黄精（Polygonatum sibiricum）地上的茎和叶为试验材料，水为提取溶剂分别对黄精的茎和叶进行试验，得到优化后的提取工艺。研究发现，在料液比为1∶20（g∶mL），提取时间为2 h，温度为80 ℃时，黄精茎多糖的提取率为19.87%，黄精叶多糖的提取率为17.13%。结果表明，黄精茎中的多糖含量高于叶，但总体来看黄精的茎和叶中的多糖含量还是较高的，工业生产可以考虑进一步利用。

关键词：黄精（Polygonatum sibiricum）;多糖;提取工艺;正交法

中图分类号：R283.3         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）15-0114-04

Abstract： The stems and leaves of medicinal economic plant Polygonatum sibiricum in Enshi city were used as test materials， and water was used as the extraction solvent to test the stems and leaves of Polygonatum sibiricum respectively， the optimized extraction process was obtained. The study found that when the ratio of material to liquid was 1∶20 （g∶mL）， the extraction time was 2 h and the temperature was 80 ℃， the yield of polysaccharide from Polygonatum sibiricum stems was 19.87%， the yield of polysaccharides from Polygonatum sibiricum leaf was 17.13%. The results show that the polysaccharide content in the stems of Polygonatum sibiricum are higher than that in leaves， but in general， the polysaccharide content in stems and leaves of Polygonatum sibiricum are still relatively high， and industrial production can be considered for further utilization.

Key words： Polygonatum sibiricum; polysaccharide; extraction process; orthogonal method

黄精（Polygonatum sibiricum）是百合科黄精属的多年生草本植物[1]，已被作为中草药使用超过2 000年[2]。根据烘干后根状茎的形态，习惯上将其分为大黄精、鸡头黄精、姜型黄精三大类[3]。显著的医疗作用和潜在的市场效益，使得野生黄精的可利用资源迅速缩减，如今人工种植的黄精成为市场供应的主要组成部分。随着科技的不断发展，黄精的许多药用价值陆续被发现，在临床医学方面的应用越来越广泛[4-8]。

多糖的研究利用已经渗透到临床医药、食品工程、化妆品、饲料研发的各个领域[4]。已有研究表明黄精多糖主要由半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖组成，具有调节免疫力、降低血糖和血脂、抗病毒和肿瘤等功效[5-9]。目前黄精多糖主要是从黄精块状根茎中提取出来的植物多糖，因此人们在利用该药材的时候，都主要采用其地下部分，而地上部分很少被利用。为了最大限度地发挥黄精的药用价值，提高黄精的经济效益，本研究对产于恩施的姜型黄精茎和叶中多糖的含量进行检测，并分析了黄精地上部分多糖的最优提取条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

试验所用黄精属于姜型黄精，其茎和叶由湖北省恩施州恩施市大地生物研究所提供。

试验用无水乙醇、濃硫酸、石油醚、葡萄糖、苯酚等试剂均为分析纯，购自天津市北联精细化学品开发有限公司。

1.2 试验仪器

DZF-609真空干燥箱（上海精宏设备有限公司），HH-M8D数显恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司），TDL-80-2B低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），UVWIN5紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），FA1004B 精密电子天平（上海精密科学仪器有限公司），DFY-500摇摆式高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 材料预处理 将黄精的地上茎、叶分开洗干净，将试验材料置于60 ℃烘箱中烘干，再将其茎、叶粉碎，用石油醚按照料液比1∶2（g∶mL，下同）进行脱脂，烘干备用。

1.3.2 多糖的提取与测定方法

1）多糖的提取。由于多糖溶于水而不溶于乙醇，所以采取水提法对多糖进行提取。基本流程：药材脱脂→热水浸提→离心→收集上清液→浓缩→活性炭除色素→乙醇沉淀→离心→取沉淀物溶于水中，即得到黄精多糖的粗提物[10]。

2）多糖的测定。用苯酚-硫酸法测定多糖的含量[11]。

1.3.3 制作标准曲线

1）配制葡萄糖标准溶液。将无水葡萄糖在105 ℃温度下烘干至恒重，精确称取0.1 g无水葡萄糖标准样品置于100 mL的烧杯中，加入适量的去离子水溶解，然后转移到1 000 mL容量瓶中，用去离子水定容，即为葡萄糖标准样品溶液。

2）绘制葡萄糖的标准曲线。将7支20 mL的试管编号，按表1顺序分别加入不同体积的葡萄糖标准溶液和去离子水。然后加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，再立即加入5.0 mL浓硫酸，盖上试管摇匀，置于25 ℃下保存30 min。以0号试管为参考，制作葡萄糖的标准曲线。进行3次平行试验，求平均值。用紫外分光光度计在490 nm波长处，分别测定各组试验的吸光度值。最后以吸光度值为纵坐标y，以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标x，得到标准曲线及回归方程y=10.506x+0.001 6（R2=0.995）。根据回归方程计算得出葡萄糖浓度，从而算出多糖提取率，公式如下：

多糖提取率=（C×V×N/W）×100% （1）

式中，C为比色管的溶液浓度（mg/mL），V为提取液体积（mL），N为稀释倍数，W为样品干重（g）。

1.4 单因素试验

分别设计以料液比、提取时间、提取温度3个因素作单因素试验，考察各单因素对浸提液中水溶性多糖提取率的影响情况。

1.4.1 料液比 取黄精的茎杆和叶粉末0.4 g，在1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的料液比条件下提取，考察料液比对多糖提取率的影响。试验条件为提取次数2次，提取温度80 ℃，提取时间1 h。

1.4.2 提取时间 分别取黄精的茎和叶粉末0.4 g，在1、2、3、4、5 h的时间条件下，考察提取时间对多糖提取率的影响。试验条件为提取次数2次，提取温度80 ℃，料液比1∶20。

1.4.3 提取温度 分别取黄精的茎和叶粉末0.4 g，在40、50、60、70、80、90 ℃的温度条件下，考察不同提取温度对多糖提取率的影响。试验条件为提取次数2次，料液比1∶20，提取时间1 h。

1.5 正交试验

根据单因素试验确定的范围，取黄精茎、叶混合物（按1∶1混合），进行3因素3水平正交试验（表2）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比与多糖提取率的关系 由图1可见，在试验条件为提取次数2次，提取温度80 ℃，提取时间1 h，料液比在1∶10～1∶20 g/mL时，黄精茎和叶中多糖提取率持续增长。当料液比大于1∶20时，多糖提取率不再增长，原因可能是随着料液比的增加，样品中的水溶性多糖已经全部溶解在提取液中，故选择1∶20作为提取黄精多糖的最佳料液比。

2.1.2 提取时间与多糖提取率的关系 由图2可见，在试验条件为提取次数2次、提取温度80 ℃、料液比1∶20时，黄精茎和叶中多糖的提取率在1～2 h明显增加，在2～4 h呈下降趋势，4～5 h趋于平稳，可能原因是样品中水溶性多糖在2 h左右已完全溶解，2 h后继续提取多糖含量反而降低，可能是由于长时间高温提取，导致部分水溶性多糖的糖链断裂，故选择2 h为黄精多糖的最佳提取时间。

2.1.3 提取温度与多糖提取率的关系 由图3可知，在试验条件为提取次数2次、料液比1∶20、提取时间为1 h时，黄精茎和叶中多糖的提取率在温度小于80 ℃时，随着温度升高逐渐增加，在温度为80 ℃时达到最大，但是温度超过80 ℃时，多糖的提取率呈降低趋势，可能的原因是更高的温度条件导致多糖结构被损坏，故选择黄精多糖提取温度为80 ℃。

2.2 正交试验

由表3、表4可知，优化后的最佳提取工艺组合为A2B2C2，即料液比1∶20、提取时间2 h、温度80 ℃，各因素之间交互作用不显著;在3个因素中，对多糖提取率的影响程度从高到低为提取温度、提取时间、料液比，即在黄精地上部分多糖的提取过程中主要受提取温度的影响。由表4方差分析可知，提取温度对黄精的地上部分多糖提取率有极显著影响（P<0.01）;提取时间对黄精地上部分多糖提取率有显著影响（P<0.05）;料液比对黄精地上部分多糖提取率影响不显著（P>0.05）。

2.3 验证试验

精确称取黄精茎和叶的样品混合粉末1.0 g（1∶1混合），料液比1∶20，在80 ℃的水浴锅中水浴2 h，重复3次，得到黄精茎和叶的样品混合粉末的多糖提取率为18.61%，与正交试验中的最大提取率相近，说明优化后的工艺稳定可靠，重现性比较好。

分别精确称取黄精茎和叶粉末1.0 g，以上述相同试验条件，重复3次，得黄精茎多糖平均提取率为19.87%，叶多糖平均提取率为17.13%。

3 小结与讨论

正交法优化后在黄精茎和叶等比例混合的材料中，得出最适合提取黄精多糖的工艺为料液比1∶20、提取时间2 h、温度80 ℃，多糖的提取率为18.61%。此外通过以上试验对比，发现黄精茎中多糖提取率略高于叶。

研究表明，黄精不论是茎还是叶中都含有大量的多糖。在当前黄精市场需求持续提高的情况下，对黄精的地上部分进行开发利用，可以进一步提高黄精的利用率，提升其经济效益。此外，通过本研究优化后的提取工艺，可为后续黄精地上部分开发黄精茶叶提供一定的技术支撑。

总体而言，本试验研究了黄精茎和叶中多糖的含量，为其开发利用提供了一定方向，但试验中也存在一些不足。本试验所用到的标准品葡萄糖，没有在试验之前做一个相对准确的紫外扫描吸收光谱，可能导致试验结果存在一定偏差。后续研究中可以先确定标准品葡萄糖的紫外扫描吸收光谱，以确定其最大吸收峰。同时如果要进一步得到准确的数据，在提取的过程中还要检验提取液中是否存在其他的杂质，如用紫外分光光度计测定波长时，还应该进一步鉴定提取液中是否存在蛋白质、色素等杂质。本研究提到的黄精茶叶只是考虑到多糖成分，事实上黄精地上部分的其他主要有效成分如甾体皂苷、黄酮类和生物堿也有很好的食疗价值，后续的研究中将黄精茎和叶的有效成分进行综合分析，才能实现对黄精资源最大限度的利用。

参考文献：

[1] 黄赵刚，刘志荣，夏 泉，等. 不同产地黄精中多糖含量的比较[J].时珍国医国药，2003（9）：526-527.

[2] 刘建军，刘 玲，夏 浇，等.黄精及其炮制品的薄层鉴别研究[J].中国民族民间医药，2015，24（5）：14-16.

[3] 田启建，赵 致.黄精属植物种类识别及资源分布研究[J].现代中药研究与实践， 2007（1）：18-21.

[4] 申利红，王建森，李 雅，等.植物多糖的研究及应用进展[J]. 中国农学通报， 2011，27（2）：349-352.

[5] 章栋梁，郭向莹，余南静，等.多糖生物活性及应用研究新进展[J]. 湖北农业科学， 2009， 48（9）：2282-2285.

[6] 王 艳， 董 鹏， 金晨钟，等.黄精多糖组成及其抗氧化活性分析[J]. 基因组学与应用生物学， 2019，38（5）：2191-2199.

[7] 王红玲，张渝侯，洪 艳，等.黄精多糖对哮喘患儿红细胞免疫功能影响的体外实验研究[J].中国当代儿科杂志，2002（3）：233-235.

[8] 郑春艳，汪好芬，张庭廷.黄精多糖的抑菌和抗炎作用研究[J].安徽师范大学学报（自然科学版），2010，33（3）：272-275.

[9] 孙隆儒，李 铣，郭月英，等.黄精改善小鼠学习记忆障碍等作用的研究[J].沈阳药科大学学报，2001（4）：286-289.

[10] 翟 为.昆布多糖的提取、纯化、衍生化及体外抗肿瘤活性研究[D].长春：吉林农业大学，2013.

[11] 董 群， 郑丽伊，方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究[J]. 中国药学杂志， 1996， 31（9）：550-553.