HPLC法测定生大黄、清蒸大黄的大承气汤活性成分分析

秦素红 覃俏峰

摘要：使用HPLC法同时测定生大黄、清蒸大黄的大承气汤中10个活性成分含量，色谱柱为Agilent Zorbax SB- C18（5 μm×4.6 mm×250 mm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长280、254 nm，柱温30 ℃。结果表明，生大黄和清蒸大黄的大承气汤中10个活性成分的标准曲线在检测范围内均呈良好的线性关系;方法学考察达到试验要求。生大黄和清蒸大黄的大承气汤中的10个活性成分含量均有不同程度的变化，这些变化与生大黄、清蒸大黄配伍的大承气汤作用相对应，且大黄蒽醌类成分含量的变化在一定程度上对大承气汤的功效存在着一定的影响和共性关系。

关键词：大黄;大承气汤;活性成分;HPLC

中图分类号：O657.7+2;S567.1+9         文獻标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）15-0129-07

Abstract： Simultaneous determination of 10 active ingredients in Dachengqi decoction of rhubarb and steamed rhubarb by HPLC. The column was Agilent Zorbax SB-C18（5 μm×4.6 mm×250 mm）， the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution， gradient elution， flow rate was 1 mL/min， detection wavelength was 280 nm and 254 nm， column temperature was 30 ℃. The results showed that the 10 standard curves of 10 active ingredients in Dachengqi decoction of rhubarb and steamed rhubarb showed a good linear relationship in the detection range; the methodological investigation reached the test requirements. The content of 10 active ingredients in Dachengqi decoction of rhubarb and steamed rhubarb varied to varying degrees. The content of 10 active ingredients in rhubarb and steamed rhubarb has different degrees of change. These changes correspond to the effect of Dachengqi decoction in combination with raw rhubarb and steamed rhubarb， and the content of rhubarb anthraquinones to a certain extent， there is a certain influence and common relationship on the efficacy of Dachengqitang.

Key words： rhubarb; Dachengqi decoction; active ingredients; HPLC

大承气汤出自汉代张仲景的《伤寒论》，由大黄、枳实、厚朴和芒硝组成，是泻法的代表方剂[1-3]，具有峻下热结的药效，主治阳明腑实证、热结旁流和里热实证等[4-6]。中药大黄的主要活性成分是蒽醌类化合物，以游离型与结合型2种形式存在[7，8]。大黄蒽醌类成分是中药大黄的泻下活性成分之一，厚朴中的厚朴酚类具有抗病原微生物和调节胃肠运动等作用[9]，枳实中的黄酮类具有抗炎和利尿等药理作用[10]。以上活性成分是大承气汤药理作用的主要物质基础，也是质量控制常用的指标物[11]。本试验拟采用HPLC法测定生大黄和清蒸大黄的大承气汤中10个活性成分含量变化差异，系统地研究生大黄和清蒸大黄对大承气汤活性成分的变化。

1 材料与方法

1.1 仪器

2695型高效液相色谱仪，美国Waters公司; D1810C型电子分析天平，上海申生科技有限公司;TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 试剂

芦荟大黄素（批号：160520，纯度>98%）、大黄素（批号：170224，纯度>98%）、大黄素甲醚（批号：160602，纯度>98%）、大黄酚（批号：20160124，纯度>98%）、大黄酸（批号：170219，纯度>98%）、柚皮苷（批号：161223，纯度>98%）、橙皮苷（批号：170213，纯度>98%）、新橙皮苷（批号：161226，纯度>98%）、厚朴酚（批号：161107，纯度>98%）、和厚朴酚（批号：161129，纯度>98%）均购自上海融禾医药科技发展有限公司;色谱甲醇和色谱乙腈均为美国Fisher公司提供，甲醇、乙醇和磷酸为分析纯，试验用水为超纯水。

1.3 药材

中药饮片大黄（产地四川，批号 160307001）、枳实（产地江西，批号160101771）、姜厚朴（产地陕西，批号160507021）和芒硝（产地青海，批号160307611）。生大黄、枳实、厚朴及芒硝购于广东康美药业有限公司，经广西中医药大学药用植物教研室李斌副教授鉴定，中药大黄为蓼科植物药用大黄（Rheum officinale Baill.）的干燥根和根茎，枳实为芸香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）的干燥幼果，厚朴为木兰科植物厚朴（Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）或凹叶厚朴（Magnolia officinalis Rehd. et Wils. var. biloba Rehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮，以上三味中药粉碎过10目筛。芒硝，中药名，经鉴定为硫酸盐类矿物芒硝族芒硝，为结晶体，主要含十水硫酸钠（Na2SO4·10H2O）。所用炮制品均使用上述生大黄按照《全国中药饮片炮制规范》和2015年版《中国药典》的炮制方法炮制（表1）。

1.4 方法

1.4.1 大承气汤提取液制备 按处方比例分别精密称取厚朴药材粉末、枳实、大黄、芒硝2.4、1.2、1.2、0.9 g，厚朴与枳实加超纯水50 mL浸泡30 min，加热煮沸后保持微沸30 min，500目滤布滤过，药渣再加超纯水50 mL浸泡30 min后，加热煮沸后保持微沸30 min，滤过，合并两次滤液并加入大黄粉末（生大黄、清蒸大黄）浸泡20 min，加热煮沸后保持微沸20 min，用500目滤布滤过，药渣再加超纯水30 mL，加热煮沸后保持微沸20 min，滤过，合并滤液，趁热加入芒硝，搅拌使其溶解，将滤液转移至100 mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，得大承气汤全方水提液，标记为DCQT。由于研究的是2种大黄炮制品的大承气汤，每种炮制品的大承气汤制备6份，分别编号为生DCQT 1-6，清蒸DCQT 1-6。

1.4.2 供试品溶液的制备 精确量取“1.4.1”提取液各5 mL，分别置于20 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，取适量稀释液13 000 r/min离心10 min，取上清液适量，22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得大承气汤供试品溶液[12]。

1.4.3 对照品储备液的制备 分别取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚10.80、10.70、12.50、10.50、11.20、11.00、10.80、 11.50、11.00、10.80 mg，置于10个10 mL容量瓶中，加甲醇使之溶解定容至刻度，摇匀，即得各对照品储备液。

1.4.4 混合对照品溶液的制备 分别精密吸取“1.4.3”下各对照品储备液适量，置于同一个10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混合均匀，即得混合对照品溶液。

1.5 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（5 μm×4.6 mm×250 mm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序见表2，流速1 mL/min，柱温为30 ℃，进样量10 μL，设定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷检测波长为280 nm，芦荟大黄素、大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚检测波长为254 nm。理论塔板数以橙皮苷峰计算应不低于3 000，以柚皮苷峰计算不低于4 000，以大黄素计算应不低于3 000。大承气汤中的10个活性成分都能较好地分离，样品中其他成分对测定成分无干扰（图1）。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 检测波长的选择 根据查阅的相关文献[9]以及预试验，柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷在280 nm处有最大的紫外吸收，色谱峰形良好;大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚和大黄素甲醚在254 nm  处有较强的紫外吸收。故本试验最终采用280和254 nm兩个检测波长。

2.1.2 标准曲线的制作 分别精密吸取上述一定量的对照品溶液，置棕色容量瓶中混合，甲醇定容至刻度，配制成7个不同浓度的大承气汤混合对照品溶液，进样量为10 μL，分别进样，液相色谱仪检测，测定峰面积，以浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，回归方程见表3。将混合对照品溶液逐步稀释，得一系列混合对照品溶液，分别进样，测定其信号（以峰高计）与噪声比值，将S/N=3时的浓度定为检测限（LOD），将S/N=10时的浓度定为定量限（LOQ），各组分在各自含量范围内线性关系良好（表3）。

2.1.3 精密度试验 取同一生DCQT供试品溶液，连续进样6次，测定各活性成分的峰面积，测得生DCQT中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积的RSD分别为1.59%、2.69%、2.07%、2.44%、2.51%、2.34%、2.48%、2.43%、2.93%和2.50%，RSD均小于3.00%，说明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 精密吸取同一生DCQT和清蒸DCQT供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12、24 h进样测定各DCQT供试品中10种成分的峰面积。结果表明，生DCQT供试品中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD值分别为1.78%、2.62%、1.88%、2.98%、1.95%、2.36%、1.95%、2.65%、2.11%、1.88%;清蒸DCQT供试品中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD值分别为2.51%、2.90%、1.89%、2.21%、2.57%、2.97%、2.36%、1.94%、2.55%、2.34%，其RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在   24 h内稳定。

2.1.5 重复性试验 精密量取生DCQT、清蒸DCQT样品各6份，分别测定各供试品的峰面积，计算各DCQT提取液中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均质量浓度和RSD，试验结果见表4、表5。由表4、表5可知，试验重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验 减半精密量取生DCQT、清蒸DCQT样品各6份，分别加入对照品溶液适量（柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别为1.08、1.07、1.25、1.05、1.12、1.10、1.08、1.15、1.10、1.08 mg/mL），按照供试品溶液的制备方法制备，续滤液以13 000 r/min离心10 min，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，计算各DCQT提取液中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均回收率和对应的RSD（表6、表7）。由表6、表7可知，该方法准确性良好。

2.2 样品含量测定

分别精密量取生DCQT 1-6、清蒸DCQT 1-6大承气汤提取液各5 mL，加无水乙醇定容至20 mL，摇匀，滤过，离心，0.45 μm微孔滤膜过滤进行检测分析（表8）。

3 讨论

中药方剂成分复杂，常用的检查仪器与分析方法难以进行分离和检测。本试验选用HPLC法同时测定并比较2种大黄炮制品的大承气汤中10种活性成分的含量差异，该方法简便，灵敏度高，重复性好，便于推广应用。通过结合相关文献[13]和预试验，对不同流动相、柱温、流速等因素进行考察，选择基线较平稳、分离度较好的色谱条件。本试验检测波长的选择是综合考虑大承气汤中10个主要活性成分的紫外吸收光谱，使被测活性成分都有较好的紫外吸收，通过比较后发现，柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在280 nm有较大的紫外吸收，而芦荟大黄素、大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚在254 nm有较好的紫外吸收，因此选择双波长切换法测定大承气汤中10种活性成分含量，该试验方法简单快速灵敏度高，对大承气汤的质量控制有一定的参考价值，值得应用于其他中药方剂的质量控制。

试验比较了甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸、甲醇-0.3%冰醋酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.05%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸和乙腈-0.2%磷酸等洗脱系统对出峰时间、分离度和基线的影响，结果发现，使用乙腈-0.1%磷酸系统对色谱峰分离度较好，基线较平稳，适当的调整梯度洗脱程序，都能使各峰达到良好的分离，且基线较平衡，因此本试验釆用乙腈-0.1%磷酸系统进行梯度洗脱。

本试验考察20、25、30和35 ℃柱温对分离度、出峰时间以及基线是否平稳的影响，试验结果表明，柱温对其影响较小，因此本试验柱温采用30 ℃;试验还考察了3种不同流速1.2、1.0、0.8 mL/min对分离度的影响，色谱图显示1.0 mL/min时分离度较好，基线也较平衡，故本试验采用的流速为1.0 mL/min。

由于中药复方组分的复杂性，活性成分含量低，给活性成分的检测带来了很大困难。中药复方在制备过程中由于溶媒和加热的影响，可能发生物理和化学变化，此复杂体系又是一个动态变化的，使药材中的化学成分发生各种动态变化，甚至产生新的成分（主要包括配位络合物、分子络合物等）以及药液pH变化、氧化还原反应等导致不溶性复合物的生成[14]。

使用HPLC法测定生大黄和清蒸大黄的大承气汤中的10种活性成分试验结果表明，总黄酮的含量变化没有显著性差异;厚朴酚类成分也没有显著性差异;而5个蒽醌类成分的总量有显著性差异，即生大黄的大承氣汤中蒽醌类成分含量较多。

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