广东和广西地区柑橘木虱内生细菌的分离鉴定及多样性分析

宋晓兵， 彭埃天， 凌金锋， 崔一平， 程保平， 陈 霞

广东省农业科学院植物保护研究所，广东省植物保护新技术重点实验室，广东 广州 510640

柑橘黄龙病Citrus Huanglongbing是一种毁灭性病害，能侵染各种柑橘类植物，对我国柑橘产业造成极大的威胁。柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama不仅是柑橘上的一种重要害虫，也是柑橘黄龙病的重要传播虫媒(杜丹超等，2011； Cenetal.,2012)。目前对柑橘黄龙病尚缺乏有效的防治药剂和抗病品种(宋晓兵等，2016)。加强对柑橘木虱的防治，对控制柑橘黄龙病的流行，降低害虫本身对柑橘的危害都具有重要意义(宋晓兵等，2018)。

细菌和昆虫之间除了少数属于病原菌与寄主的关系外，存在着广泛的非致病性关系，某些细菌则是寄主生长繁殖所必需的(Brummeletal.,2004; Dillon & Charnley,2002)。如昆虫肠道内生细菌在食物消化、营养吸收、繁殖及信息素的合成中发挥重要作用(Campbell,1990； Dillon & Charnley,2002； Tokudaetal.,2009)。内生细菌不仅能够为寄主的生长发育提供营养，还能合成多种生物活性物质、调节寄主的免疫、抵御病原生物的入侵和定殖等(魏舸等，2018)。柑橘木虱主要以吸食植物韧皮部汁液为主，其本身没有合成胆固醇、必需氨基酸和维生素的能力，而柑橘木虱体内普遍存在着内生细菌，为其提供生长发育所需的脂类化合物、维生素和必需氨基酸，内生细菌与木虱长期共存、互惠互利、协同进化(徐红星等，2009)。目前，国外已提出一种创新性的病虫害管理策略——共生控制(paratransgenic control)，即利用寄主的共生细菌控制昆虫媒介或病原体(Bextineetal.,2004； Koloraetal.,2015)。如基于胞质不相容性(cytoplasmic incompatibility，CI)的原理，将携带Wolbachia的雄蚊与不携带或者携带不同Wolbachia体型的雌蚊交配，雌蚊产的卵将不会孵化(潘晓玲等，2014； 周丽丽等，2010； Dutraetal.,2016)。

本研究通过分离培养及鉴定不同地区柑橘木虱内生细菌，一方面明确柑橘木虱可培养内生菌的区域多样性，为研究内生细菌与柑橘木虱之间的互作提供基础；另一方面探讨内生细菌在柑橘木虱生命活动中所起的作用，对利用潜在的候选细菌通过共生控制防治柑橘木虱或黄龙病具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试柑橘木虱

柑橘木虱成虫分别采集自广东省广州市白云区钟落潭镇(默科特)、广州市天河区五山大丰街(九里香)、惠州市龙门县永汉镇(沙糖橘)、肇庆市德庆县九市镇(贡柑)、肇庆市高要区新桥镇(贡柑)、阳江市阳西县儒洞镇(马水橘)、河源市紫金县蓝塘镇(春甜橘)和广西桂林市灵川县大圩镇(蜜橘)共8个地区，每个地区采集成虫20头，重复采集2次。采集的柑橘木虱成虫(雌雄随机)连同其寄主嫩梢枝叶置于塑料瓶中带回实验室，室温保存1～2 d内进行分离。

1.2 试剂和引物

2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans2K DNA Marker购自全式金生物技术(北京)有限公司；DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。PCR引物对27F/1492R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 培养基

YEB液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母浸出粉5 g、蔗糖5 g、氯化钠5 g、七水硫酸镁1 mmol·L-1、蒸馏水定容至1000 mL、pH为7.0。

YEB固体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母浸出粉5 g、蔗糖5 g、氯化钠5 g、七水硫酸镁1 mmol·L-1、琼脂粉15 g、蒸馏水定容至1000 mL、pH为7.0。

1.4 内生细菌的分离

田间采集的柑橘木虱成虫置于无菌离心管中带回实验室，将木虱置于-20℃冰箱中冷冻3～5 min，降低木虱的活动能力，然后分装于1.5 mL离心管内，每管5头，重复4次。在超净工作台上进行分离操作，将木虱置于70%乙醇中浸泡30 s，随后用无菌水漂洗3～4次，最后一次漂洗液涂平板验证灭菌效果。将柑橘木虱于无菌滤纸上晾干后置于灭菌离心管中，加入500 μL YEB液体培养基，然后用一次性组织研磨杵将虫体完全捣碎，分别吸取100 μL混合液涂布到YEB平板培养基上，每管涂布5个平板，28 ℃倒置培养2～3 d后观察菌落形态。根据菌落形态(大小、形状、颜色、表面光泽、透明度和质地等)分别挑取培养基表面不同种类的细菌菌落，在相应培养基平板上纯化，纯化内生细菌接种于YEB培养基斜面上，4 ℃保存备用。

1.5 内生细菌分子鉴定

1.5.1 DNA提取 将平板上长出的所有不同形态细菌挑出，并将其进一步纯化，得到单菌落。然后将接种单菌落至YEB液体培养基振荡培养24 h，28 ℃，120 r·min-1。取适量菌液于1.5 mL离心管中，10000 r·min-1离心30 s，弃去上清液，采用DNA提取试剂盒提取菌株的总DNA。

1.5.2 16S rDNA基因PCR扩增 根据Lane (1991)的方法，采用引物对27F/1492R (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增细菌的16S rDNA基因V1～V9区。PCR反应体系：模板1.0 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR产物，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测后剩余的PCR产物用于后续实验。

1.5.3 16S rDNA基因测序及比对 于琼脂糖凝胶上割取PCR产物的目的条带，利用Axygen胶回收试剂盒回收纯化，然后送至Invitrogen公司利用引物27F/1492R进行两端测序。利用DNAStar软件(DNASTAR Inc， Madison，USA)对所获得的目的基因序列进行拼接，然后利用BLAST程序进行序列相似性比对，从而鉴定所分离的柑橘木虱内生细菌的种属。

1.5.4 系统发育分析 选取所有地区的优势菌株序列，利用软件MEGA 6.0进行聚类分析，采用邻近相接法(NJ)构建系统进化树。对分离优势菌株数量居多的几个地区采用Venny 2.1在线软件(https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)制作韦恩图。

2 结果与分析

2.1 柑橘木虱内生细菌的分离

对采集自广东、广西8个地区的柑橘木虱进行内生细菌的分离培养，共分离保存形态特征各异的柑橘木虱内生细菌114株，其中,广州市白云区钟落潭镇(BY)17株，广州市天河区五山大丰街(TH)12株，广东省德庆县九市镇(DQ)11株，广东省高要市新桥镇(GY)20株，广西省桂林市灵川县大圩镇(GX)10株，广东省龙门县永汉镇(LM)17株，广东省阳西县儒洞镇(YX)12株，广东省紫金县蓝塘镇(ZJ)15株。部分内生细菌的形态如图1。根据菌落形态(大小、形状、颜色、表面光泽、透明度和质地等)分别挑取培养基表面不同种类的细菌菌落，在相应培养基平板上划线纯化，接种于YEB培养基斜面上，4 ℃保存。

图1 柑橘木虱部分内生细菌的菌落形态Fig.1 Colony morphologies of several endophytic bacterial isolates from D. citri

2.2 内生细菌16S rDNA基因扩增

分别提取柑橘木虱内生细菌的总DNA，采用引物对27F/1492R扩增细菌的16S rDNA基因V1-V9区，产物长度1500 bp左右。电泳结果显示，分离获得的柑橘木虱内生细菌均扩增到明亮条带，与预期的PCR产物长度相同(图2、图3)。

图2 柑橘木虱(白云)内生细菌的16S rDNA基因PCR扩增分析Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA genes of endophytic bacteria in D. citri from BaiyunM:Trans2K DNA Marker；1～17:模板为17个内生细菌的基因组DNA。M: Trans2K DNA Marker; 1-17: The templates were genomic DNA samples of 17 endophytic bacterial isolates.

图3 柑橘木虱(天河)内生细菌的16S rDNA基因PCR扩增分析Fig.3 PCR amplification of 16S rDNA genes of endophytic bacteria in D. citri from TianheM:Trans2K DNA Marker；1～12:模板为12个内生细菌的基因组DNA。M: Trans2K DNA Marker; 1-12: The templates were genomic DNA samples of 12 endophytic bacterial isolates.

2.3 柑橘木虱内生细菌多样性分析

对获得的目的基因序列进行拼接，获得114个细菌16S rDNA序列，利用BLAST程序进行序列相似性比对，将所分离的内生细菌归为细菌界的3个门的15个属，分别为厚壁菌门Firmicutes杆菌纲Bacilli芽孢杆菌属Bacillus、葡萄球菌属Staphylococcus、乳球菌属Lactococcus、芽孢八叠球菌属Sporosarcina和喜氨菌属Ammoniphilus；变形菌门Proteobacteria γ-变形菌纲Gammaproteobacteria的假单胞菌属Pseudomonas、泛菌属Pantoea、肠杆菌属Enterobacter，α-变形菌纲Alphaproteobacteria的副球菌属Paracoccus、短波单胞菌属Brevundimonas和赤杆菌属Erythrobacter，β-变形菌纲Betaproteobacteria的代尔夫特菌属Delftia；放线菌门Actinobacteria微球菌纲Micrococcales的微球菌属Micrococcus、考克氏菌属Kocuria和短小杆菌属Curtobacterium。选取有代表性的特异性菌株序列15个上传到GenBank中(表1)。

在114个柑橘木虱可培养内生细菌中，芽孢杆菌属59株为优势菌群，占分离细菌总数的51.75%；假单胞菌属14株，占12.28%；泛菌属10株，占8.77%；其他细菌占27.19%，在各个地区的柑橘木虱中不稳定存在、仅在某些地区存在的细菌可能来源于自然环境或植物寄主，并未与柑橘木虱之间形成真正的共生关系，属于过路菌群。不同地区柑橘木虱可培养内生细菌种类和数量存在明显差异，其中白云采集的木虱获得的细菌种类最多，归为8个属17株；阳西采集的木虱获得的细菌种类最少，归为2个属12株(表2)。

表1 15株代表性柑橘木虱内生细菌的鉴定情况Table 1 Identification of 15 representative endophytic bacteria of D. citri

表2 柑橘木虱可培养内生细菌的鉴定分类Table 2 Identification of endophytic bacterial isolates from D. citri

2.4 优势内生细菌聚类分析

选取所有地区的芽孢杆菌属菌株序列，采用软件MEGA 6.0进行聚类分析，构建系统进化树。聚类结果表明，柑橘木虱芽孢杆菌属59个菌株,主要为巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium21株、短小芽孢杆菌B.pumilus19株、蜡状芽孢杆菌B.cereus14株和吉氏芽孢杆菌B.gibsonii5株(图4)。7个地区芽孢杆菌的聚类结果显示，4个种类的芽孢杆菌在7个地区的分布存在差异，巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌在多数地区(均为6个)均有分布，吉氏芽孢杆菌仅在广西、德庆、白云3个地区分布(图4)。对芽孢杆菌属细菌分离数量居多的高要、龙门、阳西和广西4个地区，利用Venny 2.1在线软件制作韦恩图。结果显示，巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌是4个地区共有的芽孢杆菌属细菌(图5)，说明这2种细菌在柑橘木虱体内有更广泛的适用性。

3 讨论与结论

柑橘木虱内生细菌菌群是一个复杂敏感的生物系统，不同的地理区域条件下的内生细菌的菌群结构不尽相同。本研究中源自8个地区的柑橘木虱可培养内生细菌114株。以柑橘为寄主的7个地区采集的木虱上均分离到芽孢杆菌，而天河九里香上采集的柑橘木虱未分离到芽孢杆菌，这可能与寄主差异有关，推测柑橘木虱的内生细菌有一部分来源于寄主植物，可能是柑橘木虱取食寄主汁液，将细菌从寄主植物转移到体内，其种群结构会随着寄主植物的改变而变化。聚类进化分析表明，优势菌群芽孢杆菌属主要归为4个种类,本研究未分离到对昆虫具有致死效果的苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis。巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌均能产生细菌素(王伟等，2019)，芽孢杆菌细菌素具有较高的应用价值，可用于多种作物病虫害的生物防治(李依韦等，2019； 杨得强等，2020; 张玉栋，2016)。本研究筛选到的芽孢杆菌是否对植物病原菌有抑制效果有待下一步研究。

杨金霞(2013)利用TSB培养基添加柞蚕蛹血淋巴分离柑橘木虱培养内生细菌，获得8种内生细菌：木糖葡萄球菌Staphylococcusxylosus、葡萄球菌属Staphylococcussp.、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、肠杆菌属Enterobactersp.、短小杆菌属的Curtobacteriumoceanosedimentum、砖红色微杆菌Microbacteriumtestacyeum、嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia、柠檬色短小杆菌Curtobacteriumcifreum，与本研究结果较一致，除嗜麦芽寡养单胞菌外的7种内生细菌都能归到本研究所分离的15个细菌属中。孙丽琴(2014)对不携带黄龙病菌的柑橘木虱进行分离鉴定，共获得14株菌株，分属于芽孢杆菌属、欧文氏菌属Erwinia、克雷伯氏杆菌属Klebsiella、葡萄球菌属、节杆菌属Arthrobacter、泛菌属、果胶杆菌属Pectobacterium、沙门氏菌属Salmonella、链霉菌属Streptomyces、Massiliabrevitalea等10个细菌属，与本研究所分离的15个属存在较大差异，可能是由于地域、寄主差异及分离培养条件不同所致。

图4 柑橘木虱优势内生细菌多样性聚类Fig.4 Cluster analysis of dominant endophytic bacterial species of D. citri

图5 基于4个地区芽孢杆菌属细菌的韦恩图Fig.5 Venn diagram of Bacillus bacteria in 4 regions

王爱华等(2010)采用常规方法分离培养柑橘内生细菌，共获得21株可培养内生细菌，分别归为芽孢杆菌属、假单胞菌属Pseudomonas和葡萄球菌属等，其中芽孢杆菌属细菌为优势菌属，共有11株，与本研究分离到的优势菌属相一致。殷幼平等(2011)从柑橘木虱中发现了大量的条件致病菌成团泛菌Pantoeaagglomerans，已有研究报道成团泛生菌属和木糖氧化产碱菌属Alcaligenesxylosoxidans细菌被认为是共生控制的候选细菌(Blakeetal.,2004； Riehleetal.,2007)，成团泛菌与柑橘木虱的相互作用值得深入研究。Koloraetal. (2015)采用标准分离方法培养柑橘木虱内生细菌，分离出短小芽孢杆菌属Lysinibacillus、类芽孢杆菌属Paenibacillus、蜡状芽孢杆菌属Bacilluscereus、腐生葡萄球菌属Staphylococcussaprophyticus、链霉菌属、肠杆菌属、成团泛生菌属、恶臭假单胞菌属Pseudomonasputida、木糖氧化产碱菌属和无色杆菌属Chryseomonasluteola，与本研究所分离的内生细菌的种类大致相同。综上，芽孢杆菌目的细菌广泛分布在各地柑橘木虱体内，值得作为潜在的候选细菌进行共生控制柑橘木虱的研究。

内生细菌与宿主的免疫系统、外来病原、环境变化、营养摄入，甚至内生细菌种群之间都相互影响与相互适应，形成复杂的互作关系(魏舸等，2018)。在昆虫内生细菌的功能研究中，分析微生物的生物群落及多样性必不可少，分离、培养、鉴定是研究昆虫内生细菌的经典方法。然而，昆虫体内的复杂环境难以在体外模拟，多数昆虫共生细菌都无法在体外进行培养。因此，长期以来有关昆虫共生细菌的多样性及互作研究进展缓慢。本研究仅采用了YEB培养基进行柑橘木虱内生细菌的分离培养，对于一些难培养细菌可能存在没有分离出来的情况，如柑橘木虱内共生菌Wolbachia、Carsonella、Oscillospira、Arsenophonus、Profftella等(李翌菡，2016； 殷幼平等，2011； Blakeetal.,2004; Songetal.,2019； Subandiyahetal.,2000)，下一步需要通过高通量测序技术对柑橘木虱体内细菌组成及菌群多样性进行分析，以进行柑橘木虱内生细菌的多样性以及功能研究。

利用转基因技术改造昆虫内生细菌，用于共生控制人类病害、害虫及植物病害虫媒等具有广阔的应用前景。如：通过改造猎蝽共生菌Rhodococcusrhodnii表达cecropin A，对引起美洲锥虫病的克氏锥虫TrypanosomacruziChagas有良好的抑制效果(Beardetal.,1992)；通过改造按蚊共生细菌Serratia AS1分泌表达多种抗疟活性蛋白，从而在按蚊体内能高效特异杀灭恶性疟原虫(Wangetal.,2017)；通过改造叶蝉共生菌Alcaligenessp.有效控制葡萄皮尔斯病的传播(Bextineetal.,2004)。本研究对于今后利用柑橘木虱内生细菌自身的特性，抑或通过转基因技术改造内生细菌，在控制柑橘黄龙病和阻断虫媒的传播上具有重要借鉴意义。