红景天苷微乳的制备及其体外透皮吸收研究

杨克冰1 徐智慧1 许晓波1 陈 刚 黄晓军 吕伯东

1.浙江省人民医院(杭州医学院附属人民医院)泌尿外科，浙江 杭州 310014；2.浙江中医药大学附属第二医院泌尿外科，浙江 杭州 310005

红景天是一种高原产区的多年生草本植物，入药来源为景天科植物大花红景天Rhodiolacrenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba的干燥根和根茎，可益气活血、通脉平喘[1]。其主要成分红景天苷不仅具有很强的抗氧化作用，还具有抗肝、肾纤维化作用[2]。前期研究发现，红景天苷在体外具有抗阴茎海绵体平滑肌纤维化作用[3]。长期阴茎海绵体纤维化可进一步导致男性勃起功能障碍[4]，且目前尚未见用于防治阴茎海绵体纤维化的体外透皮制剂报道。而微乳(Microemulsion)是由油相、水相、表面活性剂及助表面活性剂构成的一种油水混合体系，微乳透皮给药系统可提高药物在制剂中的含量，扩大药物的浓度梯度，并增加药物的溶解性，与普通透皮制剂相比具有更强的促渗作用[5]，在临床男科中可作为一种新型理想得药物释放载体。鉴于此，本研究拟将红景天苷制成用于防止阴茎海绵体纤维化的外用微乳制剂，选用SD大鼠皮肤进行初步观察，并从其质量、体外释放、透皮、体外药动学方面进行综合性评价，以期为今后开发研究防治男性勃起功能障碍的外用药物提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 XT-120A型电子天平(瑞士Precisa公司)，TK-20A型透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司)，高效液相色谱Shimadzu LC系统(岛津企业管理(中国)有限公司)，Zetasizer Nano S90粒径仪(英国马尔文仪器有限公司)。

1.2 材料 红景天苷(陕西慧科植物开发有限公司)；乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；吐温80(国药集团化学试剂有限公司)；油酸(国药集团化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾(国药集团化学试剂有限公司)；氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(国药集团化学试剂有限公司)；SD大鼠(浙江省动物实验中心)；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 红景天苷含量测定方法

2.1.1 色谱条件的选择 采用Inertsil®ODS-SP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5μm)，流动相为甲醇∶水=15∶85，流速1.0 mL/min，进样量50 μL，柱温40 ℃，检测波长225 nm。

图1 红景天苷含量测定方法的线性回归曲线

2.1.2 标准溶液的配制 精密称取红景天苷5.0 mg，置10 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容，得500 μg/mL的标准溶液。

2.1.3 线性关系考察[6]精密量取500 μg/mL的标准溶液，以流动相稀释制备得浓度分别为50.0 μg/mL、10.0 μg/mL、5.0 μg/mL、1.0 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL的对照品溶液。以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标做线性回归曲线。线性回归曲线如图1所示，线性方程为：A=13125C+689.8 (r2=0.9999,n=6)，结果表明：红景天苷溶液在0.25～50 μg/mL的浓度范围内，其浓度与峰面积成良好的线性关系。

2.1.4 精密度实验 分别取0.25 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1的红景天苷对照品溶液各10 μL，每个浓度重复进样5 次, 计算RSD值。测得结果见表1，RSD均小于2%，表明精密度良好，均符合方法学要求。

2.1.5 专属性考察[7]将制备好的大鼠皮肤固定于Franz扩散仪上，角质层朝上，真皮层与接收池(扩散面积为3.14 cm2，体积为18 mL)内接收介质接触，接收介质是pH7.4磷酸盐缓冲溶液。设定水浴温度为32 ℃，磁力搅拌子转速为200 r/min，4 h后取出接收液即为空白皮肤接收液。将空白皮肤接收液、红景天苷标准对照溶液按照2.1.1的色谱条件各进样50 μL，记录色谱图，结果如图2、图3所示。实验表明：红景天苷标准对照溶液在14 min处出峰，空白皮肤接收液在此处没有无峰，说明红景天苷出峰处无杂峰干扰，此分析方法专属性较好。

表1 红景天苷含量测定的精密度 (n=5)

图2 红景天苷对照品HPLC色谱图

图3 空白皮肤接收液HPLC色谱图

2.2 微乳的制备与评价

2.2.1 微乳的制备 本实验采用HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance，亲水亲油平衡值)法制备微乳[8]。以油酸和吐温-80作为油相，蒸馏水作为水相，乙醇作为助乳化剂。在预试验基础上，确定微乳配方如下：油酸55%，吐温-80 16%，乙醇16%，水12.97%。按照处方，各取1.6 g油酸和吐温-80混匀作为油相，取30 mg红景天苷溶于1.297 g蒸馏水中作为水相，室温下缓慢地将水相滴加到油相中，同时逐滴加入1.6 g助乳化剂乙醇，磁力搅拌15 min，超声除去气泡，直至溶液呈澄明稠状液体，即得微乳。取微乳加水稀释混匀，点样，干燥，用1%磷钨酸染色，透射电镜观察，显示微乳呈球状。室温下取适量微乳加水稀释，以激光粒度分析仪测定微乳的平均粒径为(65.56±4.62)nm。

2.2.2 微乳的稳定性评价 取适量微乳置于离心管中，室温下以转速4000 r/min离心15 min，离心后微乳溶液无分层现象，说明微乳稳定性较好，结果如图4所示。

图4 微乳稳定性评价结果

2.3 体外透皮吸收实验

2.3.1 离体皮肤的制备 取体重250～300g的SD大鼠，处死后剪下腹部皮肤，铝箔包裹，置于-70 ℃冰箱保存。透皮试验前取出大鼠皮肤，室温解冻，去除皮下脂肪和毛细血管，用蒸馏水冲洗干净后备用[9]。

2.3.2 体外透皮实验方法 将制备好的大鼠皮肤固定于Franz扩散仪上，角质层朝上，取1 g红景天苷微乳涂抹于角质层，确保与皮肤紧密接触，真皮层与接收池(扩散面积为3.14 cm2，体积为18 mL)内接收介质接触，接收介质是pH7.4磷酸盐缓冲溶液。设定水浴温度为32 ℃，磁力搅拌子转速为200 r/min。向接收池内注满接收液并排除气泡，分别在2、4、6、9、12、24 h于接收池取样1.0 mL，每次取样后补加同体积的新鲜接受液并排除气泡。用0.45 μm微孔滤膜过滤，按照2.1含量测定方法计算样品溶液中的红景天苷含量。按照以下公式计算红景天苷的累积透过量Q(Cumulative Amount Permeated，CAP)：

以红景天苷累积透过量Q对时间t作图，得红景天苷微乳体外透皮曲线图，结果见图5。经线性拟合得体外透皮方程为：Q=0.6953t-0.8648(r2=0.9908)，稳态透皮速率为0.6953 μg·cm-2·h-1。预实验中得红景天苷水溶液体外透皮方程为：Q=0.3216t-0.5856(r2=0.9977)，相应的稳态透皮速率为0.3216 μg·cm-2·h-1。实验结果表明红景天苷微乳24 h稳态透皮速率较红景天苷水溶液显著提高。

图5 红景天苷微乳体外透皮曲线图(n=3)

3 讨论

3.1 红景天苷的效用 吴万征等[10]研究显示，红景天苷具有明显的抗缺氧、抗衰老功效；张士更等[4]、陈刚等[11]研究发现红景天苷能显著抑制缺氧引起的大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(Corpus Cavernosum Smooth Muscle Cells，CCSMC)合成型标志物骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)、TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达升高，同时能有效抑制缺氧性损伤引起的CCSMC凋亡，从而具有抗阴茎海绵体平滑肌纤维化作用。

3.2 微乳制剂的结果 笔者所在课题组致力于研究红景天苷在男科临床当中的应用，探寻合适的药物载体。在前期进行细胞实验后，本实验进行红景天苷微乳制剂的研究，实验结果显示，通过预实验确定的微乳配方，采用HLB法成功制备的平均粒径为(65.56±4.62) nm且在室温下稳定性良好的红景天苷微乳制剂，体外透皮实验结果显示其稳定性好，透皮速率高；且制剂方法操作简便，制备时间短，对设备要求不高，为微乳用于红景天苷体外透皮制剂的制备奠定实验基础。

3.3 研究方向的提示 微乳给药系统促渗作用明显[12]，且可以增加药物的稳定性，提高生物利用度[13]。但本实验微乳处方中使用的助溶剂乙醇对皮肤有一定的刺激性，故寻求一种更高效、低毒的油相基质是今后我们研究方向。将进行红景天苷微乳的动物在体实验，对其抗阴茎海绵体纤维化作用进行重点研究，深入探讨中药微乳制剂的动物在体作用机制和疗效，为防治勃起功能障碍外用透皮制剂的进一步研发提供参考。