基于网络药理学探讨岗松挥发油的药理作用

1. 河南省中医院，河南 郑州 450002；2.郑州大学药学院，河南 郑州 450001

岗松BaeckeafrutescensL.为桃金娘科岗松属植物，广布于东南亚及我国的南部地区，是重要的香料及药用植物资源。岗松挥发油为岗松枝叶经水蒸气蒸馏法制得，为淡黄色至淡棕黄色的澄清液体，具有特殊香味[1]，以其为主要原料的香精产品、防蚊轻工品在市场上颇受青睐[2-3]；此外作为广西习用中药收载于《广西中药材标准》、广西壮族自治区《壮药质量标准》，具有杀虫止痒、清热利湿、祛痱、止痛、除湿的功效[4-6]。

网络药理学是在系统生物学、多向药理学和计算机技术基础上，以“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络为理念，运用专业的可视化网络分析软件及算法，对现有数据库信息进行虚拟筛选和网络预测，从而揭示药物对疾病网络的干预和影响；其研究的整体性与中药多成分、多靶点、多途径的作用特点相吻合，成为解析中药复杂体系的有利工具[7-9]。目前，岗松油多用于皮肤湿疹、淋病、瘙痒、疥疮、滴虫性阴道炎及脚癣的治疗，但缺乏较为系统深入的现代药理研究。本文拟采用网络药理学技术方法，通过分析构建“成分-靶标-通路-疾病-组织”网络，对岗松油药效组分、药理作用及其机制进行预测，为岗松油在医药领域的进一步研发利用提供科学依据。

1 方法

1.1 岗松挥发油化学成分及靶蛋白筛选 通过文献检索整理岗松挥发油化学成分，结合Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.gov/)获得岗松挥发油相关化学成分的CAS号及SMILES结构式，借助TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、SEA(http://sea.bkslab.org/)及SwissTargetPrediction(http:// swissTarGetprediction.ch/)等数据库筛选化学成分相关靶蛋白，并导入Cytoscape 3.6.0构建岗松挥发油“成分-靶点”网络。

1.2 PPI网络构建及关键靶标筛选 通过STRING 11.0数据库(https://string-db.org/)，对岗松油化学成分靶标进行蛋白相互作用(PPI)分析，选择物种“Homo spaiens”，设定最低相互作用阈值为中等置信度“Medium confidence(0.4)”，并导入Cytoscape 3.6.0构建构建PPI网络图；结合网络拓扑分析，选取大于2倍平均度值(degree)的靶标作为关键靶标。

1.3 GO分析及KEGG通路富集 利用生物学信息注释数据库DAVID(https://david.ncifcrf. gov/，Version 6.8)，对岗松挥发油关键靶标进行GO功能和KEGG通路富集分析，设置标识符为“official gene symbol”，限定物种为“homo sapiens”，并通过R语言将GO、KEGG分析结果可视化。

1.4 疾病及组织分析 利用DAVID数据库对岗松挥发油关键靶标进行疾病、组织富集分析，并导入Cytoscape 3.6.0 构建“疾病分析”“组织分布”网络图。

2 结果与分析

2.1 岗松挥发油“成分-靶点”网络 经文献及数据库检索收集岗松挥发油化学成分66个(表1)，相关靶蛋白542个；利用Cytoscape 3.6.0构建“化学成分-靶点”网络如图1所示，该网络中共有608个节点，包括成分节点66个(方形)、靶点节点542个(圆形)；2863条边，分别代表“成分-对应靶点”之间的相互关系；节点大小及颜色深浅与节点的degree值(网络中和该节点相连的节点数量)呈正比。其中，20、26、56、36、58、40、31、59、21、43、28、39、10、42、1、17、18、46等18个化合物的degree值较大，提示为岗松挥发油发挥药效的主要活性成分。

表1 岗松挥发油化合物信息

续表1表1 岗松挥发油化合物信息

图1 岗松挥发油“化学成分-靶点”网络图

2.2 关键靶标 通过STRING 11.0数据库构建542个靶蛋白相互作用关系，并导入Cytoscape 3.6.0中进行可视化处理；以大于平均degree(31.587)的2倍为标准，筛选出符合条件的46个关键靶标，结果如图2所示。

2.3 GO生物功能与KEGG通路富集分析

2.3.1 GO分析 通过GO分析，共确定了424个GO条目(Pvalue<10-6)：细胞组分(CC)涉及膜筏、膜微结构域、膜区、质膜筏、小窝、基地外侧质膜等15个条目，分子功能(MF)涉及蛋白激酶结合、激酶结合、血红素结合、四吡咯结合、核受体结合等23个条目，生物过程(BP)涉及脂多糖相关反应、蛋白质定位建立的调控、细菌源分子相关反应、细胞对有机环状化合物的反应、炎症反应的调节等386个相关条目，GO富集结果如图3所示。

图2 关键靶蛋白互作网络图

图3 关键靶标-GO分析条形图

2.3.2 KEGG分析 通过KEGG富集分析，共确定了92条相关通路(Pvalue<10-6)，包括癌症相关通路(癌症中的蛋白多糖、癌症通路、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌等)、传染病相关通路(乙肝、利什曼病、结核、百日咳等)、信号转导通路(TNF信号通路、HIF-1信号通路等)、内分泌和代谢相关通路(糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、雌激素信号通路、催乳素信号通路等)等，KEGG通路分析结果如图4所示。

2.4 疾病分析 使用DAVID数据库对关键靶点进行疾病分析，共得到266个相关疾病(Pvalue<10-6，FDR<0.01)，主要涉及多种癌症疾病(结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等)、妇科疾病(子宫内膜异位症、复发性妊娠损失、绝经后的骨质疏松症等)、慢性疾病(慢性阻塞性肺疾病、2型糖尿病等)等。结果如图5所示。

图4 关键靶标-KEGG通路富集分析

图5 关键靶标-疾病分析结果

2.5 组织分析 使用DAVID数据库对关键靶点进行组织分析(Pvalue<0.05)，共得到32个相关组织，包括小脑(正常)、骨髓(BM-CD34+、BM-CD33+)、骨骼肌、扁桃体、颈神经节、唾液腺、肝脏(正常、肿瘤)等组织，结果如图6所示。图中圆形节点代表关键靶标，方形节点代表组织，节点颜色深浅与节点degree值呈正比。

2.6 岗松挥发油关键靶标-作用通路-疾病-组织网络 将46个关键靶标及排名前10的KEGG通路、疾病、组织分析结果一起导入Cytoscape 3.6.0中构建“关键靶标-作用通路-疾病-组织”网络图，如图7所示。其中，圆形代表关键靶点(46个)，六边形代表通路(10个)，正方形代表疾病(10个)，菱形代表组织(10个)。

图6 关键靶标-组织分布结果

图7 岗松挥发油关键靶标-作用通路-疾病-组织网络图

3 讨论

挥发油类为岗松主要化学成分之一，文章基于网络药理学分析探讨其药效组分、药理作用及机制。通过数据库检索筛选岗松油化学成分66个，对应靶点542个，其中橙花叔醇、龙脑、丁香酚、乙酸橙花酯、香芹酚、α-Cadinol、α-Elemene、乙酸香叶酯、d-柠檬烯、百里香酚、γ-Eudesmol、冰片、芳樟醇等18个化合物在“化学成分-靶点”网络图中degree值较大，可作为主要活性成分；通过AKT1、ALB、IL6、MAPK3、TP53、VEGFA、SRC、TNF、CASP3等关键靶标，主要参与脂多糖相关反应、蛋白质定位建立的调控、细菌源分子相关反应、炎症反应等生物过程，作用于包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症中的蛋白多糖通路、内分泌抵抗通路、IL-17信号通路在内的多种癌症通路、传染病通路、信号转导通路、内分泌和代谢相关通路等发挥作用；且疾病分析和组织分布显示，岗松油主要作用于小脑、骨髓、骨骼肌、扁桃体等组织及器官，可对结直肠癌、前列腺癌、慢性阻塞性肺疾病、子宫内膜异位症等多种癌症、慢性疾病、妇科疾病及其他病症发挥治疗作用。

含岗松油的多为外用制剂，对外治滴虫性阴道炎、皮肤湿疹、蛇虫咬伤、烧烫伤等具有抗菌消炎、清洁护肤等作用[10-11]，而对本研究所预测的多种癌症、慢性疾病及妇科病等尚未有报道；其中糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路表明[12-15]，AGE、RAGE可通过诱导PI3K-Akt依赖的信号途径激活，进而产生NF-κB活性，促进细胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α)、促凋亡相关基因CASP3、细胞增殖导致肾功能不全相关基因CYCD1、及促血管形成相关基因VEGF等的表达，从而诱发糖尿病并发症；癌症相关通路表明[16-19]，所筛选的关键靶标通过多通路多靶点，对下游多个通路进行整体调控，如激活cAMP信号通路进而激活PKA、激活PI3K-Akt信号通路进而连续激活PKB/Akt，使下游相关靶点磷酸化被激活或抑制等，这些作用通路均与癌症相关；因此，网络药理学分析在阐释传统药效机制的同时，也进一步挖掘了岗松油其可能的、潜在的药理作用。

本研究通过构建岗松挥发油“化学成分-靶标-通路-疾病-组织”网络，分析探讨其发挥药理作用的活性成分、作用靶点及通路，为岗松油后续的系统深入研究提供理论依据。