响应面法优化新疆风味调和茶总糖的提取工艺

袁巧云, 张建梅, 唐 钰, 张 良, 顾 倩, 尚 志, 胡卫成

(淮阴师范学院 生命科学学院, 江苏 淮安 223300)

0 引言

新疆风味调和茶是新疆保健茶类的一种,迄今已有1600多年历史.明朝谈修在《滴露漫录》中就有所指:以其腥肉之食,非茶不消;青稞之热,非茶不解[1]．新疆人民根据传统医药知识和日常生活经验,以茶为基础,添加多种药食两用植物,总结和实践出的一系列用于日常调养以增加营养[2],预防疾病的功能性饮品,形成了独具特色的新疆风味调和茶,茶水汤色红浓,滋味芳香,醇厚可口[3]．同时维吾尔医学认为常饮调和茶具有消除疲劳、舒肝养胃、祛风驱寒、提神壮肾和利尿的神奇功效,其配方一年四季均有不同,会产生不同的功效,夏季可以消暑生津解渴,冬季则有增加热量和御寒的功效[4]．

总糖即为糖类物质的总量,包括各种单糖、双糖及多糖中的淀粉,其中多糖是糖天然存在的重要形式[5]．多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键连接形成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物[6],是参与生命活动与代谢调节的重要成分,具有多种生物活性功能和药理活性[7-9],如：抗肿瘤、抗炎、增加免疫力、降血糖[10]、抗辐射、降血脂、保肝等[11]．

已有文献对新疆风味调和茶营养成分或与其功效相关的活性成分进行了研究分析[12-13],但尚未发现关于该茶糖类成分分析的相关报道．本文以新疆风味调和茶为原料,在单因素实验的基础上,通过响应面法[14-16]优化其总糖的提取工艺,为新疆风味调和茶的进一步研发提供基础数据和研究资料．

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新疆风味调和茶是由多种原料混合研磨制成,配方如下:豆蔻3 g，红花6 g，玫瑰6 g，丁香0.6 g，薄荷4 g，小茴香3 g，甘草2 g，干姜0.6 g，姜黄1 g，茯砖茶30 g. 经单独研磨后,过18目筛,24 h冻干处理后,混合．葡萄糖(分析纯),浓硫酸(分析纯),5%苯酚(分析纯),化学品均购自国药集团化学试剂有限公司．

ALPHA1-2型冷冻干燥机(德国Christ公司);HH-8型数显恒温水浴锅(江苏亿通电子有限公司);5810R型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司); DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);Tecan Infinite M200 Pro型酶标仪(瑞士Tecan公司)．

1.2 实验方法

1.2.1 总糖提取方法

称取一定量的新疆风味调和茶粉末,于一定温度水浴锅中水浴提取一定时间,每30 min振动离心管,充分混匀料液．水浴完毕,4 000 r/min离心10 min,收集上清液定容至50 mL．取5 mL定容后的溶液冷冻在-20℃冰箱．各取5 mL经处理的冷冻样品水浴化开,涡旋振荡(2 800 r/min, 0.5 min),每个样品各取1 mL,4 000 r/min离心10 min．

1.2.2 标准曲线制作

称取经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品50 mg,用水溶解于50 mL的容量瓶中定容,配制成1 mg/mL的葡萄糖标准液．

分别吸取葡萄糖标准溶液0,50,100,200,300,400和500 μL置于10 mL试管中,各加超纯水至1 mL,再依次加入1 mL配制好的5%苯酚溶液,5 mL浓硫酸,移至涡旋仪,涡旋至混合均匀无分层,将试管置于30℃水浴锅中水浴30 min,移至涡旋仪上涡旋．依次吸取200 μL的溶液于96孔板,置于酶标仪中在波长为490 nm处,测其OD值．以葡萄糖质量浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线,标准方程为:Y=0.0062X+0.0078,R2=0.9994．式中:Y为吸光度,X为总糖质量浓度(g/mL)．

1.2.3 总糖提取量测定

称取0.5 g新疆风味调和茶粉末,加超纯水溶解,水浴加热,4 000 r/min下离心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶,得到待测样品溶液．取500 μL样品溶液,用苯酚-硫酸法测定总糖的含量,按照标准曲线的测定方法,测定样品的OD值,根据回归方程计算得到新疆风味调和茶溶液中总糖的提取量．

1.2.4 总糖提取单因素实验

1) 提取温度对总糖提取的影响

分别称取0.5 g新疆风味调和茶粉末于50 mL离心管中,按料液比1:30 g/g加入超纯水,混合均匀,分别于60,70,80,90和100℃条件下浸提2 h,考察不同温度对新疆风味调和茶总糖提取量的影响．

2) 提取时间对总糖提取的影响

分别称取0.5 g新疆风味调和茶粉末于50 mL离心管中,按料液比1:30 g/g加入超纯水,混合均匀,于90℃条件下,分别浸提0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.0 h,考察不同提取时间对新疆风味调和茶总糖提取量的影响．

3) 料液比对总糖提取的影响

表1 Box-Behnken实验因素与水平

分别称取0.5 g新疆风味调和茶粉末于50 mL离心管中,料液比1:10,1:20,1:30,1:40和1:50 g/g依次加入超纯水,混合均匀,于90℃条件下,浸提2 h,考察不同料液比对新疆风味调和茶总糖提取量的影响．

1.2.5 响应面分析法对提取工艺的优化

根据以上单因素实验的结果确定因素水平范围,依据Box-Behnken设计原理得到本次实验中影响新疆风味调和茶总糖提取因素分别如下:提取温度为80,90和100℃,提取时间为1.5,2.0和2.5 h,料液比为1:20,1:30和1:40(g/g),按测定总糖量的方法,应用响应面分析法对新疆风味调和茶的提取工艺进行优化．实验因素与水平见表1．

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度对总糖提取量的影响

由图1可知,随着提取温度的升高,新疆风味调和茶总糖提取率逐渐升高,当提取温度由60℃上升到70℃时,新疆风味调和茶总糖提取率上升较快,说明含糖量增加幅度大．当提取温度80℃到100℃时,曲线趋势比较平稳,当提取温度达到100℃时,总糖提取量的得率最高为7.89%,由于高温可能影响到多糖的结构与其活性,当提取温度超过100℃时,多糖易降解失活,所以选择100℃为新疆风味调和茶总糖提取的最适温度．

2.1.2 时间对总糖提取量的影响

由图2可知,随着提取时间的延长,新疆风味调和茶总糖提取量呈升高的趋势．在0.5-2 h的范围内,相应的含糖量显著增加．当提取时间为2 h时,总糖的得率为7.60%,将时间延长到2.5 h后,总糖的得率只增加了0.01%,为了缩短加工时间,减少能源消耗,故选择2 h为新疆风味调和茶总糖的最佳提取时间．

图1 提取温度对总糖提取率的影响 图2 提取时间对总糖提取率的影响

2.1.3 料液比对总糖提取量的影响

由图3可知,新疆风味调和茶的总糖提取量随料液比的增大而增加．当料液比从1:10增大到1:20,总糖得率增加了1.98%,说明料液比对其影响显著．当料液比为1:40,1:50时,其提取率之间无显著差异,为了节约成本,选择料液比为1:40(g/g)较为合适．

图3 料液比对总糖提取率的影响

表2 响应面法实验设计与结果

2.2 响应面法实验结果

2.2.1 Box-Behnken实验设计及结果

在单因素实验结果的基础上,选取有较显著影响的提取温度,提取时间,料液比,分别以A,B,C表示,以总糖提取量为响应值进行响应面分析(Design Expert V8.0.6软件),实验设计及结果见表2．

表3 方差分析结果

2.2.2 回归模型建立与显著性分析

根据Design Expert V8.0.6软件处理,由实验数据所得新疆风味调和茶总糖提取量与提取温度,提取时间,料液比的二次多元回归方程为:Y=848.14+42.20A+3.39B+61.49C-4.71AB-14.82AC+2.87BC+6.84A2-3.58B2+0.93C2

由表3回归方程方差分析结果可知,由实验数据所得模型的p值为0.0014,表示该模型具有极显著性,回归方程中因素A-温度和C-料液比对新疆风味调和茶提取总糖量影响极显著,且两因素中的因素C-料液比对提取量的影响更加显著其他因素不显著．根据方程变量系数大小可知,影响总糖提取量的因素依次是:C-料液比>A-温度>B-时间．

图4 任意两变量对总糖提取率影响的响应等高线图

2.2.3 响应面分析与提取工艺优化

根据提取温度,提取时间和料液比对新疆风味调和茶总糖的提取量的影响,绘制响应等高线图．由图4可知,提取温度,提取时间和料液比对新疆风味调和茶总糖的提取量都有影响且三者之间存在交互作用．利用Design Expert V8.0.6软件进行模拟计算,以总糖提取量为评价指标,得到新疆风味调和茶提取的最优工艺是:提取温度100℃,提取时间2.02 h,料液比1:40．为了验证响应面最优提取工艺数据的有效性,采用最优工艺对新疆风味调和茶进行提取验证实验,得总糖提取量为944.35 g/mL,与响应面法模拟出的理论值944.84 μg/mL基本一致,说明回归方程与实际情况拟合较好,响应面分析实验进一步证明了该优化工艺的可靠性．

3 结论

以总糖提取量为评价指标,在单因素实验的基础上,采用苯酚-硫酸法建立新疆风味调和茶的总糖测定方法,应用响应面法进行优化,用Box-Behnken实验设计原理得到新疆风味调和茶总糖提取的最优工艺为:提取温度100℃,提取时间2.02 h,料液比1:40．采用以上最优工艺对新疆风味调和茶进行实验,得到总糖提取量为944.35 g/mL,接近于响应面法模拟所得出的理论值,说明该优化工艺较为可靠．

新疆风味调和茶具有较广泛的营养、保健和药理功效,深入研究该调和茶的无机盐、氨基酸及糖类等营养成分并研究活性成分的药效机制具有重要意义．本文优化了新疆风味调和茶总糖的提取工艺,为大量制备活性糖类成分,进一步研究新疆风味调和茶的功效和工业化生产提供了基础数据和研究资料．