刺五加、板蓝根中残留有机氯农药提取条件优化

韩艺凡，缪文丽，张慧慧，冷运儒，郎 朗

(哈尔滨商业大学 英才学院，哈尔滨 150076)

刺五加和板蓝根药用的由来已久，是中国传统中药.刺五加味辛、微苦、性温，具有益气健脾、补肾安神的功效[1]，适用于肾肺两虚、心脾不足、失眠多梦等症[2]，近代临床研究表明，刺五加中含有多种活性化学成分，具有抗衰老，抗癌，降血糖等作用[3-6]，目前广泛用于治疗风湿病、冠心病、心绞痛和脑梗死等[7].板蓝根性味苦寒，具有清热解毒、凉血、利咽的功效[8]，适用于温热发病，痈肿疮毒等[9]，在临床上常被用于治疗流感、扁桃体炎、毛细支气管炎、防治流行性乙型脑炎等[10-12]，板蓝根颗粒能有效预防流行性感冒发热，为家庭常备药[13].有机氯农药的危害极大，可影响男性生育功能，有致畸和潜在的致癌威胁[14]，药材中有机氯农药的残留不仅会影响药材质量，食用后还会堆积于脂肪组织，损伤机体，危害人类健康[15].因此建立能够准确测定有机氯农药残留的方法变得极为重要.本试验以刺五加、板蓝根为实验材料，对影响超声提取法提取效率的3个因素(提取温度、提取时间、丙酮-二氯甲烷组成比例)进行正交试验，并结合气相色谱法进行残留农药的含量测定，选出最优提取条件，为合理安全使用中药材提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺五加：辽宁省朝阳市某中草药种植产业协会；

板蓝根：吉林抚松县某大型中药材种植基地.

浓硫酸(优级纯)、正己烷(分析纯)、丙酮(分析纯)、二氯甲烷(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯)、氯化钠(分析纯)、正己烷(色谱纯)试剂均为国产.

标准品与供试样品：六氯苯(HCBs)、γ-六六六(γ-HCH)、七氯(Heptachlor)、反式氯丹(Trans-chlordane)(质量浓度20 μg/mL)、p, p′-DDT(质量浓度100 μg/mL)、艾氏剂(Aldrin)均购自国家标准物质研究中心.

1.2 仪器

美国Agilent公司生产的MSD 质谱检测器和6890N气相色谱仪(ECD检测器)；郑州长城科工贸有限公司生产的SHB-Ⅲ型循环水真空泵；上海一恒科技有限公司生产的DZF-6030A型真空干燥箱；深圳市洁盟清洗设备有限公司生产的JP-030ST型超声波清洗机；

1.3 色谱条件

选用规格为HP-5 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)的Agilent弹性石英毛细管柱，进样口温度为290 ℃；检测器的温度300 ℃；进样量为1.0 μL；色谱柱进行程序升温：开始温度为100 ℃，恒温1 min，先以10 ℃/min的升温速率加热至200 ℃，恒温2 min，再以8 ℃/min的升温速率加热至280 ℃，恒温2 min；采取不分流进样方式，将N2(>99.999%)作为载气：1.5 mL/min(恒流)，外标法定量.电子电离源；电离能量为70 eV；发射电流为0.2 mA；光电倍增器的电压350 V；离子源的加热温度为200 ℃；气相色谱接口温度为285 ℃；扫描质量范围为50～450 amu；扫描速度为1 s/scan；溶剂延迟时间为4 min.

1.4 试验方法

1.4.1 提取方法

准确称取2.0 g样品药材与10 g无水硫酸钠于250 mL具塞锥形瓶内混匀，呈松散状.加入30 mL一定比例的丙酮-二氯甲烷(2+1、1+1、1+2)浸泡12 h，超声提取一定时间(15、20、25 min).静置5 min，过滤，适用旋蒸瓶直接收集滤液，所剩残渣再分别加入30 mL丙酮，重复超声提取3次，并合滤液.将提取液于一定温度(20、30、40 ℃)水浴上减压浓缩，加5 mL正己烷，操作如上，反复几次至溶液近干，即可除净二氯甲烷和丙酮.将所得溶液转移到离心管中，正己烷定容至5 mL.缓慢加入1 mL浓硫酸，振荡摇动约1 min，离心(3 000 r·min-1) 10 min.取上清液，即得.

1.4.2 有机氯农药残留量测定方法

1) 标准品溶液制备

用正己烷分别将六氯苯、γ-六六六、七氯、艾氏剂、p, p′-DDT、反式氯丹6种农药标准品制成质量浓度为10 μg/mL的标准品储备液.精密量取1 mL标准品储备液定容至10 mL容量瓶中，得到质量浓度均为1 μg/mL的混合标准品储备液.

2) 建立标准曲线

将质量浓度为1 μg/mL的标准品储备液，分别用正己 烷稀释成5个不同的质量浓度，其中六氯苯、七氯、反式氯丹、p, p′-DDT分别配制成质量浓度为5、50、100、200、1 000 μg/L标准品溶液；γ-六六六、艾氏剂分别配制成质量浓度为5、50、100、200、250 μg/L标准品溶液.按照“1.3”的条件进样，平行3次试验，进行线性回归，利用Excel制作标准曲线，计算回归方程.

3) 有机氯农药残留量的测量

取3份供试品药材，按“1.4.1”制备供试品，按“1.3”进样，进行GC分析，得到相应的峰面积，根据回归方程计算供试样品药材中残留的含有机氯农药量.

1.4.3 正交试验优化

选取提取温度、提取时间、丙酮-二氯甲烷组成比例3个因素作为考察对象分别为A、B、C.如表1所示，选择3个水平设计正交试验，选用L9(34)正交表，把其中一列视为空白列，对比实验结果筛选出最优提取条件.

表1 刺五加、板蓝根中有机氯正交设计因素水平表

2 试验结果与讨论

2.1 有机氯农药的标准曲线

6种有机氯农药均具有良好的线性关系，相关数据见表2.在测定刺五加和板蓝根中残留的含有机氯农药量时，只需将通过色谱法得到的峰面积值代入对应有机氯农药的回归方程，即可计算出相应含农药残留量.

表2 有机氯农药的回归方程、相关系数及线性范围

2.2 正交试验结果

刺五加中检测出p, p′-DDT、六氯苯和七氯三种有机氯农药残留，表3为三种农药的正交试验结果，表4为结果分析，表5为方差分析.板蓝根中检测出p, p′-DDT和七氯两种有机氯农药残留，结果见表6～8.表6为两种农药的正交试验结果，表7为结果分析，表8为方差分析.由正交试验结果可知，提取温度、提取时间和丙酮-二氯甲烷组成比例对刺五加、板蓝根中残留有机氯农药的提取效果影响趋势相同.由方差分析可知，提取温度和提取时间对刺五加、板蓝根中残留有机氯农药的提取均具有显著影响，而溶剂比例对农药的提取无显著影响，确定其影响因素的大小是：A>B>C，即提取温度(℃)>提取时间(min)>丙酮-二氯甲烷组成比例.由表3、4和表6、7可知刺五加、板蓝根中有机氯农药提取的最优方案均为A3B3C3，即最优提取条件为：提取温度40 ℃、提取时间25 min、丙酮-二氯甲烷(1+2)作提取溶剂.

表3 刺五加中有机氯试验方案及试验结果

表4 刺五加中有机氯试验结果分析

表5 刺五加中有机氯方差分析

表6 板蓝根中有机氯试验方案及试验结果

表7 板蓝根中有机氯试验结果分析

含p.p'-DDT量/(μg·kg-1)K184.38101.00125.76135.22K2111.51135.70125.27113.88K3186.03145.22130.89132.82k128.1333.6741.9245.07k237.1745.2341.7637.96k362.0148.4143.6344.27极差R33.8814.741.877.11因素主次ABC优方案A3B3C3

表8 板蓝根中有机氯方差分析

3 结 语

本文通过方差分析确定三因素的影响大小为顺序为: 提取温度(℃)>提取时间(min)>丙酮-二氯甲烷组成比例.实验结果表明刺五加、板蓝根中残留有机氯农药的最优提取条件为：A3B3C3，即在40 ℃下用30mL的丙酮-二氯甲烷(1+2)超声提取25 min.