基于AQP4、Kir4.1及Ras/Raf-1/ERK信号通路和F-ERG探讨活血通络方对视网膜静脉阻塞大鼠视网膜功能的影响*

庞 午 杨 荣 刁 科 张 越 杨赞章 李明然 张铭连

视网膜静脉阻塞(Retinal vein occlusion，RVO)是临床上常见的视网膜血管疾病之一，分为中央型及分支型，该病发病急，病势重，临床上以受累静脉迂曲扩张，血流瘀滞，出血、水肿、渗出为主要表现，发病因素多种，与视网膜炎症、视网膜低灌注、高血压、动脉硬化、血液高黏度、血流动力学异常、外伤等因素有密切关系[1]。RVO是中医眼科治疗的优势病种，根据全身辨证结合眼局部病情，给予中药治疗，往往能够获得较好疗效。张铭连教授结合多年临床经验，拟活血通络方，调血通络，利水渗湿，主要治疗缺血性眼病，且疗效显著[2-4]。本研究以F-ERG和AQP4、Kir4.1及Ras/Raf-1/ERK信号通路为切入点，探讨活血通络方治疗RVO的作用机制和临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料试验材料：大鼠：使用清洁级雄性SD大鼠25只(河北医科大学试验动物中心提供)，体质量(180±20)g，无眼部疾病。中药：活血通络方由黄芪30 g，当归尾、赤芍各12 g，川芎10 g，桃仁10 g，红花10 g，水蛭6 g，丹参12 g，葛根30 g，丝瓜络10 g，郁金10 g，石菖蒲10 g，泽兰10 g，茺蔚子15 g，金银花30 g构成。500 ml水浸泡上述药物4 h，大火煎沸，后改为文火煎至250 ml，按照体表面积计算法给药。实验药物：4%多聚甲醛(中国，Solarbi公司)，苏木素染液(中国，Solarbi公司)，伊红染液(中国，Solarbi公司)，AQP4抗体、Kir4.1抗体、p-Erk1/2抗体、Ras抗体、p-Raf-1抗体(美国，Abcam公司),β-actin抗体(中国，博士德公司)，生物素标记山羊抗小鼠 IgG(中国，博士德公司)，眼前节照相机(日本，佳能)，电生理仪(美国，罗兰，RETIport32)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组将大鼠随机分为3组，实验对照组5只，给予左眼视网膜光凝封闭分支静脉，术后给予生理盐水2 ml/d，灌胃；中药实验组5只，光凝术式同实验对照组，术后给予活血利水通络方2 ml/d，灌胃。正常空白对照组5只，未予光凝造模。

1.2.2 视网膜分支静脉阻塞模型制作10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔麻醉大鼠，全麻满意后，复方托吡卡胺滴眼液滴左眼以散瞳，尾静脉注射3%孟加拉红注射液40 mg/kg(配置方法：孟加拉红0.3 g，溶解于10 ml生理盐水中，充分溶解后，通过一次性针头过滤器过滤以灭菌)。5 min后丁卡因滴眼液对大鼠左眼表面麻醉，随后覆盖盖玻片以观察眼底。以左眼为实验眼，右眼为对照眼。而后将大鼠置于激光器前，选择一支距视盘约1PD距离，与动脉较远的视网膜静脉进行激光照射，激光参数：532 nm波长绿光，能量 100 mW，光斑直径50 μm，曝光时间0.2 s，激光点数80～125次，待激光处静脉呈变细，血流中断，远端血管充盈迂曲时，改用85 mW能量补充激光若干点以巩固效果[5]，第2天行眼底血管造影确定造模成功。见图1。

注：(a)图箭头处为视网膜静阻病变处，静脉血流中断，周围视网膜水肿、出血。(b)图显示FFA检查35 s时静脉回流受阻，提示视网膜分支静脉阻塞造模成功图1 视网膜分支静脉阻塞造模

1.2.3 实验大鼠视网膜F-ERG b波检测经造模实验大鼠均在视网膜激光前行F-ERG检测，造模成功后，于术后第3天、第6天再次行F-ERG检测。大鼠暗适应30 min后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，复方托吡卡胺点眼散大瞳孔，丁卡因滴眼液点眼表麻角膜，固定大鼠于水浴平台上，安置电极，作用电极尽量与角膜产生最大接触，参考电极置于耳后，地电极置于尾根部，整个操作过程在暗红光下进行。操作时白光闪烁，具体参数：白光闪烁全视野反应持续10 ms，闪光强度10.02 cd/(m2·c)，每个时间点至少检查3次，记录b波振幅值。

1.2.4 实验大鼠视网膜相关蛋白表达量检测经实验大鼠(空白对照组及成功造模后大鼠)过量麻醉处死，迅速摘除实验眼球，置于冰浴中，依次去除角膜、虹膜、晶状体及玻璃体，获取视网膜后迅速放入液氮罐中，后置于-80 ℃冰箱保存。采用BCA蛋白定量试剂盒检测样本蛋白浓度，按Westernblot试验步骤分别检测AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-ERK1/2蛋白的表达情况，根据目的蛋白和内参蛋白((-actin)对应灰度值的比值计算蛋白的相对表达水平。

1.2.5 统计学方法实验数据使用SPSS 18.0统计软件进行分析， 计量资料采用均数±标准差表示，多样本均数间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 活血利水通络方对大鼠视网膜分支静脉阻塞F-ERG的影响各组造模前ERG b波振幅进行两两比较，差异无显著性意义(P>0.05)。造模后2组b波振幅较造模前均下降，与术前比较具有显著性差异(P<0.01)。中药实验组造模后第3天、第6天的b波振幅相对于实验对照组恢复较好，且第6天时恢复明显好于实验对照组，且趋于正常，在各时间与实验对照组比较差异有显著性意义(P<0.01)。见表1。

表1 2组视网膜分支静脉阻塞模式大鼠视网膜F-ERG b波波幅比较 (只，

2.2 Western-blot检测AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-Erk1/2蛋白的表达AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-Erk1/2在正常视网膜具有表达，成功造模后第6天取材，实验对照组的AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-Erk1/2水平与空白对照组比较，P<0.01；中医实验组的AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-Erk1/2水平与实验对照组比较，P<0.01。见表2、图2、图3。

表2 3组大鼠视网膜中AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-Erk1/2的表达 (只，

注：A为空白对照组，B为实验对照组，C为中药实验组图2 不同组各检测蛋白的表达比较

3 讨论

眼为窍穴，内涵脉络。视网膜静脉为目中络脉的一部分，具有渗灌气血、发越神光的作用。RVO是目络急病之一，在中医上分属于“络损暴盲”“视瞻昏渺”范畴，该病的主要病机是目络瘀阻，血溢脉外[6]。中医学认为血水同源[7]，且相互转化，生理上，唐容川《血证论》指出 “血与水皆阴也”“水为血之倡，气行则水行，水行则血行”。在病理上，《金匮要略》言：“经为血，血不利则为水”，《血证论》则强调了“血病而不离乎水”“水病而不离乎血”的病理关系。因此在治疗上，要求水血同治。

注：(a)至(e)依次为AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf1、p-Erk1/2的条形图图3 检测目的蛋白表达的条形图

张铭连教授提出了目络学说[8，9]，认为目络疾病的病因以热、毒、痰、湿、郁、瘀、虚为主，而目络瘀阻是其主要病机。RVO会造成视网膜组织的缺血缺氧，从而引起视网膜屏障破坏，引起的视网膜出血、水肿[10]。因此在治疗上，主张以调血通络为主要治则，兼以利水渗湿，并自拟活血通络方，奏活血通脉利水之效。方中应用黄芪，一可滋补元气，二可助行血有力；赤芍、川芎、当归尾、丹参配伍桃仁、红花，可活血散瘀，行气通络，再配合丝瓜络、水蛭，可增通络化瘀之效；葛根、郁金、石菖蒲，宣扬气机，醒脑开窍；泽兰、茺蔚子相用，可活血利水消肿，诸药合用，相得益彰，共奏益气活血、化瘀通络之功。

RVO造成血-视网膜屏障破坏，导致视网膜细胞外水肿，血管内血浆渗漏到神经上皮层内，视网膜呈灰白色水肿[11，12]。Müller细胞作为视网膜主要的胶质细胞，贯穿整个视网膜，参与血-视网膜屏障的建立，维持视网膜胞外环境的稳态，和视网膜组织中的离子和水的稳态。液体吸收是通过水通道蛋白通过膜内水传递介导的，这些水转运蛋白促进跨膜的水流双向运动。AQP4在Müller细胞上表达最为丰富。而细胞膜表达多种钾离子通道蛋白，其中与水转运有关的主要是Kir4.1。任何影响AQP4与钾通道通透性的因素，均可以造成视网膜水的转运障碍，导致Müller细胞肿胀、视网膜组织水肿[13]。

本研究应用活血通络方治疗视网膜分支静脉阻塞实验，通过中药活血通络散瘀之效，奏利水消肿明目之功。Westernblot实验结果提示，通过应用活血通络方治疗视网膜静脉阻塞大鼠后，AQP4、Kir4.1的表达均低于实验对照组(P<0.01)。这种差异表明AQP4、Kir4.1抑制了视网膜水肿的加重，对视网膜具有保护作用，具有目络再通、水湿消退功效，维持视网膜功能作用。

视网膜静脉阻塞发生后，视网膜组织产生缺血缺氧环境，缺氧的环境直接诱导VEGF因子的表达增多[14]，而VEGF是血管内皮细胞特异的促有丝分裂素，正常生理水平的VEGF能够维持视网膜血管的稳定性，但因病理情况引起的VEGF过度表达会促进血管的异常增殖，同时增加血管的渗透性，导致视网膜水肿、出血[15]。 Ras/Raf-1/ERK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族中重要的成员之一，是一个蛋白激酶级联反应，是调控细胞增殖、分化、生存和凋亡的重要途径[16，17]。Ras/Raf-1/ERK是VEGF的下游信号，参与VEGF表达变化的调控。Ras在信号通路中处于中枢地位，当Ras受到细胞外信号刺激后，继而激活Raf-1，进一步磷酸化ERK1/2，产生一系列效应酶，从而调控细胞应答，影响血管生成的发生、发展过程[18]。在视网膜分支静脉阻塞的条件下，Ras、p-Raf-1及p-ERK1/2表达均升高，但是应用活血通络方后，中药实验组与实验对照组对比，Ras、p-Raf-1及p-ERK1/2的表达较低，差异有统计学意义(P<0.01)，提示活血通络方能够抑制RVO发生后VEGF增多，改善视网膜缺血、缺氧、水肿情况。

F-ERG b波集中反应了视网膜双极细胞和Müller细胞的电活动，视网膜内层组织，特别是颗粒细胞层参与了b波的形成[19]。a波来自光感受器层，它主要反映视网膜光感受器的电位变化[20]。当视网膜缺血损伤发生时，首先影响b波，b波组织对缺血的影响比产生a波的组织更明显[21]。本实验结果提示：在视网膜分支静脉阻塞条件下，应用活血通络方的大鼠视网膜b波恢复在术后第3天、第6天时均较实验对照组有明显提升，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示应用活血通络方后，受累的静脉周围视网膜组织功能能够得到有效的恢复。

由此可见，在视网膜静脉阻塞条件下，活血通络方能够抑制AQP4、Kir4.1的表达，调控Ras/Raf-1/ERK信号通路，抑制VEGF的表达，保护视网膜功能，改善视网膜缺血缺氧环境，证实了活血通络方治疗视网膜分支静脉阻塞的有效性，值得在临床中大力推广和应用。