CLDN23基因在结肠癌中的临床意义和预后价值

张政，郑东，尹晶平，朱琼芳，丰斌，梁玉婷，黄惠芳，邱骏

(苏州大学附属第一医院临床检测中心，江苏苏州 215006)

结直肠癌是世界第三大常见恶性肿瘤，目前已证实多种因素与结直肠癌的发生、发展密切相关[1]。研究显示，吸烟、饮酒、超重或肥胖、缺乏运动、蔬菜水果摄入量低、红色肉类和加工肉类摄入量高等因素约占我国结直肠癌发病率和死亡率的46%[2]。虽然TNM分期系统被临床用于指导结直肠癌患者的治疗和预后，但也存在一定的局限，例如，相同病理类型、TNM分期和治疗方案的患者预后和结局可能完全不同[3]。因此，研究者开始关注于寻找预后分子标志物，以指导结直肠癌的临床决策。

CLDN23(claudin-23)基因是claudin基因家族的成员之一。Claudins蛋白家族是组成细胞间紧密连接必不可少的骨架蛋白，能维持细胞间的完整性，调节离子和分子的扩散，并参与维持细胞极性和细胞间信号的传递[4-5]。研究指出，claudins蛋白的异常表达往往影响肿瘤细胞的生物学行为[6]。CLDN23基因被报道与胃癌[7]、胰腺癌[8]等肿瘤的发生、发展存在关联，表明CLDN23是一个潜在的肿瘤分子标志物。本研究通过生物信息学的方法，综合多种数据库，探讨CLDN23基因在结肠癌中的临床和预后意义，旨为结肠癌提供新型预后分子标志物。

1 材料与方法

1.1转录本测序数据的下载与处理 下载癌症基因图谱数据库(TCGA)中结肠癌转录本测序数据。其中包括结肠癌组织样本473例，正常组织对照41例。使用R 3.6.0软件提取CLDN23基因在结肠癌组织和正常组织中的表达量，利用Mann-WhitneyU检验比较2组间的表达差异。基于CLDN23基因在结肠癌组织表达水平的中位值，将患者分为高、低表达2组。

1.2临床数据的下载与处理 下载TCGA中结肠癌患者的临床资料，删除临床资料缺失和生存时间为0的患者信息，提取患者的临床特征(包括年龄、性别、T分期、N分期、M分期和病理Stage分期)。利用卡方检验分析CLDN23基因表达与患者临床病理参数的关系。

1.3CLDN23基因与结肠癌患者预后关系的分析 使用Log rank检验分析高、低表达2组之间总体生存率的差异。使用单因素和多因素Cox回归分析与结肠癌患者预后相关的临床因素，探讨CLDN23基因表达在结肠癌中的预后价值。

1.4GEPIA和OncoLnc数据库分析 使用GEPIA数据库验证CLDN23基因在结肠癌中的表达以及与患者的预后关系。在GEPIA数据库界面中，设置条件如下：(1)Gene中输入“CLDN23”；(2)Datasets Selection选择COAD；(3)Matched Normal data选择“Match TCGA normal data”； (4)Methods选择Overall Survival和Disease Free Survival，其他条件选择默认。此外，OncoLnc数据库亦被用于验证分析CLDN23基因与结肠癌患者总体生存率的关系。

1.5统计学分析 使用 R 3.6.0 软件和 IBM SPSS Statistics 25.0 软件进行统计学分析。使用非参数检验(Mann-WhitneyU检验)分析CLDN23基因在结肠癌组织和正常组织中的表达差异，使用卡方检验分析CLDN23与患者临床病理参数的关系。生存分析使用Log rank检验，单因素和多因素Cox回归用于分析CLDN23基因在结肠癌中的预后作用。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CLDN23基因在结肠癌组织中显著下调CLDN23基因在TCGA中的肿瘤表达情况见图1A。在TCGA结肠癌数据集中，共有41例正常组织，473例结肠癌组织。Mann-WhitneyU检验结果显示，与正常组织相比，CLDN23基因在结肠癌组织中的表达下调(P<0.001)(图1B)。删除非配对的样本，只保留41对癌组织和癌旁组织进行分析，结果显示，CLDN23基因在结肠癌组织中表达显著降低(P<0.001)(图1C)。UALCAN数据库和GEPIA数据库分析结果也表明了CLDN23基因在结肠癌样本中表达下调(图1D、1E)。

2.2CLDN23基因与结肠癌患者临床病理参数的关系 卡方检验分析结果显示，CLDN23与结肠癌患者的N分期显著相关(P=0.046)。见表1。

表1 CLDN23基因与结肠癌患者临床病理参数的相关性分析(n)

2.3CLDN23基因与结肠癌患者预后的相关性分析 使用Log rank检验分析高、低表达2组患者的总体生存率的差异，结果见图2A。与高表达组相比，低表达CLDN23基因患者的总体生存率较差(P=0.018)。GEPIA数据库分析显示，低表达CLDN23基因患者的总体生存率较差(P=0.04，图2B)，但CLDN23基因表达与患者的无病生存期无显著关联(P=0.88，图2C)。OncoLnc数据库分析表明，低表达CLDN23基因的结肠癌患者的总体生存率不良(P=0.017，图2D)。

2.4CLDN23基因可作为结肠癌的独立预后因子 在TCGA结肠癌中，结合患者的临床资料和生存数据，使用单因素和多因素Cox回归分析CLDN23基因的预后作用。单因素Cox回归分析结果显示，年龄、病理分期、T分期、N分期、M分期均可以影响结肠癌患者的生存(P<0.05)；而多因素Cox回归分析结果显示，只有年龄(HR=1.04,95%CI:1.01～1.06,P=0.002)和CLDN23基因表达(HR=1.47,95%CI:1.09～1.96,P=0.01)可以作为结肠癌患者的独立预后因子，见表2。

表2 单因素和多因素Cox回归分析

3 讨论

研究表明，上皮细胞极性是影响癌症起始和转移形成的主要因素，上皮细胞极性的丧失可促进细胞发生上皮-间质转化(EMT)和恶性转化，在肿瘤发生的起始阶段和肿瘤发展的后期具有重要作用[9]。上皮细胞的极性取决于包括紧密连接(tight junctions，TJs)和粘附连接的顶端连接复合体的建立[10]。紧密连接是这些细胞间连接中最顶端的，在维持细胞极性和调节细胞旁通透性中起着至关重要的作用，它可以通过下调或上调紧密连接蛋白来改变紧密连接，从而触发恶性转化，致使癌症进展[11-12]。CLDNs(Claudins)是紧密连接的核心组件，对紧密连接的形成至关重要。CLDNs蛋白会形成细胞旁屏障，可以封闭上皮层，维持细胞极性以及控制离子和小分子在上皮细胞之间的流通，此外，这些蛋白质还参与调节细胞形态和细胞间信号如WNT/β-catenin、JAK-STAT3和Notch信号级联等途径[13-15]。

目前，有许多学者进行了CLDNs基因/蛋白质与结直肠癌的关系研究。Jiang等[16]研究表明，claudin-1的低表达与结直肠癌患者预后不良有关；通过促进TNF-α诱导的EMT可促进结直肠癌细胞的迁移[17]。claudin-2基因被报道在结直肠癌组织中表达上调，通过调控YAP活性以及miR-222-3p的表达，可以促进结直肠癌干细胞的自我更新[18]。下调的claudin-3可以通过IL-6/gp130/Stat3信号促进结肠癌恶性肿瘤的发生[19]。claudin-4表达的严重缺失被证实与结直肠癌的远处转移显著相关[20]。Wang等[21]研究指出，claudin-7蛋白在结直肠癌组织中表达下调，并通过EMT途径促进结直肠癌的侵袭和转移。claudin-11基因甲基化被报道与结直肠癌的转移和不良生存有关[22]。此外，claudin-12[23]、claudin-18[24]等均被证明在结直肠癌组织中表达异常，促进结直肠癌的发生。

本研究通过分析结肠癌数据集发现，CLDN23基因在结肠癌组织中表达显著下调，并且与患者的N分期相关。低表达的CLDN23基因与患者的总体生存率相关，且表达水平越低，患者的预后越差。多因素Cox回归分析结果提示，CLDN23基因表达可以作为结肠癌患者的独立预后因素。

有学者发现，claudin-23在结直肠癌中的表达降低，可能是受到组蛋白甲基化酶EZH2的调控，导致claudin-23基因启动子高度甲基化，因而抑制其表达, 且claudin-23可以明显提升结直肠癌细胞侵袭能力，并与肿瘤转移密切相关[25]。虽然陈薇等[25]分析了claudin-23基因在结直肠癌中的表达，但该研究仅采用了6对癌组织及相应癌旁组织进行分析，并且未探究claudin-23基因与结肠癌患者临床病理参数和预后的联系。Lu等[7]分析发现，在浅表性胃炎组织、萎缩性胃炎和胃癌组织中CLDN23基因表达水平逐渐降低，下调的CLDN23基因与肿瘤血管栓子的形成显著相关。此外，CLDN23基因被指出可以作为肠型胃癌的候选抑癌基因[26]。孙宏治等[27]研究发现，CLDN23基因在仓鼠胰腺癌组织中表达降低，并可以增强胰腺癌细胞的侵袭能力，CLDN23基因的异常表达可能激活MEK信号通路。claudin-23还可能成为防止侵袭和转移的分子治疗的新靶点[8]。

综上所述，CLDN23基因在结肠癌中表达下调，并与结肠癌恶性进展相关，提示患者不良的生存结局。因此，CLDN23基因可作为结肠癌新型的预后分子标志物，以指导结肠癌患者的临床决策。