云南汉族异常血红蛋白Hb G-Taipei患者临床表型及基因型分析*

蒋璐西，葛世军，番云华，杨必清，易薇，黄铠，褚嘉祐，杨昭庆

(1.中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所遗传室，昆明 650118； 2.云南德宏傣族景颇族自治州人民医院检验科，云南芒市 678402)

Hb G-Taipei指由于β珠蛋白基因(HBB)第68位碱基发生点突变(A>G)导致β珠蛋白第22位氨基酸发生改变(Glu>Gly)，从而引起异常血红蛋白病[1]。一项病例报道表明,单纯Hb G-Taipei杂合突变不产生明显的临床症状，但在合并β地中海贫血时可加重贫血症状[2]。目前对Hb G-Taipei临床表型的病例报道较少且多集中于杂合子，而纯合子及复合突变患者的临床表现尚不明确，临床上迫切需要这些基因变异的检验学和临床表型数据以指导诊治、产前诊断和遗传咨询。云南是我国异常血红蛋白病和地中海贫血的高发地区，珠蛋白基因复合突变产生复杂血液学表型的情况时有发生[3-4]。本研究通过对云南德宏地区3个无亲缘关系汉族家系中的7例患者进行分析，报道1例Hb G-Taipei纯合子的表型特征，分析Hb G-Taipei突变合并-α3.7地贫突变的临床表现，同时通过HBB基因簇的单倍型分析揭示云南汉族Hb G-Taipei突变的可能起源，以期为异常血红蛋白Hb G-Taipei病的临床诊断及遗传咨询提供更多的实验依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 回顾性分析2018年8月至2019年12月于云南省德宏傣族景颇族自治州人民医院行产前检查且经血红蛋白电泳检出异常血红蛋白电泳条带D(Hb D)的患者。根据筛查结果进行家系分析和基因诊断。经β珠蛋白基因Sanger测序共确证7例携带Hb G-Taipei突变的患者，男3例，女4例，年龄0.6～64岁，中位年龄30岁，均来自云南德宏地区，且为汉族，其中5例来自1个先证者家系(家系图谱见图1)，另外2例来自相互无亲缘关系的家庭。本研究通过中国医学科学院医学生物学研究所伦理委员会审核批准(No.2016-01)，患者或家属知情同意。

1.2主要仪器及试剂 XT-1800i全自动血细胞分析仪(日本Sysmex公司)，CAPILLARYS全自动血红蛋白电泳系统(法国Sebia公司)，Magpix液态悬浮芯片系统(美国Luminex公司)，5417R/5810R离心机(美国Eppendorf公司)，ND-1000分光光度计(美国Nanodrop公司)，ABI 9700 PCR仪、PRISM 3730xl DNA测序仪(美国Applied Biosystems公司)，Wide Mini-Sub Cell GT system核酸电泳系统(美国Bio-Rad公司)，GelVue UV transilluminator凝胶成像仪(英国Synoptics公司)。全血基因组 DNA 提取试剂盒(美国Axygen公司)，地中海贫血(α/β)基因检测试剂盒(广州达安基因公司)，LA Taq DNA聚合酶试剂盒(日本TaKaRa公司)，HincⅡ、HindⅢ、AvaⅡ和HinfⅠ限制性内切酶(美国NEB公司)。

1.3标本采集 采集各研究对象就诊时的空腹静脉血2.5 mL，EDTA-K2抗凝， 4 ℃保存。200 μL用于DNA提取和基因分析。其余血标本部分用于血常规检测；另一部分经5 000 r/min离心5 min去除血浆，10倍体积生理盐水洗涤红细胞2次后进行血红蛋白电泳分析。

1.4血液学表型分析 采用XT-1800i全自动血细胞分析仪及其配套试剂检测EDTA-K2抗凝静脉血标本中血红蛋白含量(Hb)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)等各项红细胞参数。各指标参考范围[5]：MCV≥80 fL，MCH≥27 pg，Hb≥120 g/L(成年男性)，Hb≥110 g/L(成年女性)，Hb≥100 g/L(6个月龄以下幼儿)，Hb≥110 g/L(7个月～6岁儿童)。采用CAPILLARYS全自动血红蛋白电泳系统及配套试剂进行HbA2、HbA等血红蛋白电泳参数检测。参考范围：HbA>94.5%，HbF<2.0%，HbA22.0%～3.5%。出现HbE、HbJ、HbD、HbK和HbH等异常电泳条带时提示有血红蛋白变异体存在，进一步行β珠蛋白和α珠蛋白基因检测。

1.5珠蛋白基因分析

1.5.1α/β珠蛋白基因检测 采用全血基因组 DNA 提取试剂盒从外周抗凝血样本中提取DNA，采用ND-1000分光光度计测定DNA浓度，取吸光度(A260/280 nm)在1.7～1.9之间的样本，短期保存置于4 ℃，长期保存置于-20 ℃。采用PCR-流式荧光杂交法，地中海贫血(α/β)基因检测试剂盒和Magpix液态悬浮芯片系统检测α珠蛋白基因常见的3种缺失型突变(--SEA、-α3.7、-α4.2)、3种点突变(αWSα、αCSα、αQSα)以及17种常见的β珠蛋白基因突变(-28、-29、-30，-32、 CD14-15、CD17、CD26、CD27-28、CD31、CD41-42、CD43、CD71-72、Int、 IVS-1-1、IVS-1-5、IVS-2-654和Cap)。结果均按照试剂盒说明书判读。

1.5.2HBB基因片段扩增 以HBB基因( NC_000011.10,GRCh38.p13)序列为模板，采用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)primer-blast工具在线设计引物，UCSC(http://genome.ucsc.edu/)In-Silico PCR工具验证引物的特异性。上游引物序列：5′-TGGTATGGGGCCAAGAGATA-3′，Tm 60.3 ℃；下游引物序列：5′-TTTGCAGCCTCACCTTCTTT-3′,Tm 60.0 ℃；产物1 973 bp。通过LA Taq DNA聚合酶进行PCR扩增HBB基因，扩增体系为30 μL，包含10 μmol/L上、下游引物各0.3 μL，10×GC buffer 3 μL，2.5 mmol/L dNTPs 3 μL，LA Taq 1.5 U，DNA模板约80 ng，ddH2O补足至30 μL。循环参数：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 45 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，38次循环;72 ℃延伸20 min。

1.5.3HBB基因簇单倍型分析 采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法检测HBB基因簇上7个多态性酶切位点的基因型，从基因簇5′端到3′端方向的位点依次为HincⅡ-ε、HindⅢ-Gγ、HindⅢ-Aγ、HincⅡ-5′ψβ、HincⅡ-3ψβ、AvaⅡ-β和HinfⅠ-β，PCR引物及反应体系与限制酶切反应条件参照文献[6]进行。根据HBB基因簇上是否存在相应限制性酶切位点判断基因型，“+”表示存在该限制性位点，“-”表示不存在该限制性位点，通过基因型推断单倍型。当HBB基因簇多态性位点的基因型为杂合状态时，若缺乏病例家系中其他直系亲属的基因型，不能确定单倍型中该位点的等位基因型，则该位点的基因型以“*”表示。

2 结果

2.1血液学表型分析结果 7例Hb G-Taipei患者中，1例(患者1)MCV<80 fL，有轻微小细胞表现但无贫血等症状；1例(患者5)呈轻度小细胞低色素贫血，该患者骨髓铁染色阴性，有缺铁可能；1例(患者6)呈轻度贫血，但无小细胞低色素表现，且无缺铁表现(血清铁蛋白168 ng/mL)；其余患者Hb、MCV、MCH均在正常水平，结果见表1。患者4(Hb G-Taipei纯合子)血红蛋白电泳未检出HbA，电泳结果出现定位区带HbA消失的现象，检出含量为96.3%的异常血红蛋白条带HbD(图2A)。其余患者(Hb G-Taipei杂合子)血红蛋白电泳结果相似，异常Hb D带含量为37.0%～40.2%，结果见图2B。

表1 Hb G-Taipei家系及2例无亲缘关系的Hb G-Taipei病例的血液学表型与基因型

2.2珠蛋白基因突变检测结果 各研究对象的基因检测结果见表1。7例Hb D异常电泳条带的患者行常规地贫基因检测,均未发现常见β地贫基因突变类型，有3例检测出携带缺失型α地贫基因(-α3.7)。PCR-DNA测序结果显示,患者HBB基因均检测出HBBc.68A>G(p.Glu22Gly)突变，在血红蛋白数据库Hb Var中该突变为Hb G-Taipei。其中1例为纯合子(图3A)，其余6例为杂合子(图3B)。

2.3单倍型分析结果 7例Hb G-Taipei患者的HBB基因簇多态位点单倍型结果见表1。通过家系分析，5例患者组成的家系中Hb G-Taipei突变与[------+]单倍型连锁。患者6也携带[------+]单倍型，Hb G-Taipei突变可能与该单倍型连锁。而患者7由于缺乏家庭成员信息，不能完成分析，但其3′端AvaⅡ-β和HinfⅠ-β 2个位点为[-+]，与其余患者相同。

3 讨论

Hb G-Taipei及其他多种异常血红蛋白可干扰糖尿病的检测[7-8]，因此检测异常血红蛋白在临床检验工作中具有重要的辅助诊断作用。Hb G-Taipei的临床鉴定主要通过血红蛋白电泳，以出现异常Hb D带为主要特征[2,9-10]。本研究中Hb G-Taipei患者检出异常Hb D带，杂合子电泳特征存在37.0%～40.2%异常Hb D带，与既往的报道结果相似。合并-α3.7突变之后无明显变化，说明-α3.7突变的存在对Hb G-Taipei突变产生的异常血红蛋白含量无影响。本研究检测并分析了纯合突变的Hb G-Taipei血液学特征，发现异常血红蛋白相对含量达到96.3%，同时由于此例纯合子合并-α3.7突变，导致HbA四聚体(α2β2)不能合成，血红蛋白电泳系统无法根据HbA对各组电泳条带进行自动定位，从而使得定位区带消失，类似定位区带消失的情况在复合型异常血红蛋白中也有发生[3-4,11]。

单纯杂合Hb G-Taipei突变通常不产生血液学改变[2,9]。本研究中Hb G-Taipei杂合子患者的临床表现由无症状至轻度贫血，与之前的报道存在共性及差异。杂合子中(患者5)轻度小细胞低色素贫血患者伴有缺铁症状，可能是缺铁和Hb G-Taipei单独或共同作用产生的相应表型。另1例轻度贫血(患者6)无小细胞低色素和缺铁症状，推测可能是营养状况和生理周期等多种因素共同引起的贫血症状。纯合子表现为无贫血症状，提示Hb G-Taipei纯合子与杂合子功能相似。静止型α地贫(-α3.7/αα)和Hb G-Taipei突变单独作用时不产生明显血液学表型[9,12]，本研究显示二者复合突变时亦不产生贫血症状。尽管Hb G-Taipei合并-α3.7时无明显临床血液学改变，但在遗传性血红蛋白病高发的云南地区，极易合并其他血红蛋白突变而产生较重的贫血症状，因此对Hb G-Taipei以及其他异常血红蛋白进行临床筛查和基因检测在血红蛋白病的风险评估中仍非常有必要。

本研究在3个汉族家系中检出Hb G-Taipei，其中2个家系存在共同单倍型[------+]，提示Hb G-Taipei突变可能与该单倍型连锁。同时检出的所有Hb G-Taipei患者的HBB基因簇单倍型存在相同的3′端[-+]，由此推测云南汉族的Hb G-Taipei突变可能有共同来源。既往报道表明，Hb G-Taipei突变主要发生于汉族和北方少数民族[13]。根据云南汉族的迁移信息，推测本研究中的Hb G-Taipei突变可能来源于北方汉族。但由于样本数量较少，且缺乏其他地区和民族的单倍型数据，不能确定Hb G-Taipei突变的源流。

综上所述，本研究对Hb G-Taipei以及合并α地贫病例的临床表征进行分析，为血红蛋白疾病筛查、基因诊断和遗传咨询提供了更多参考依据，并初步揭示了云南德宏地区Hb G-Taipei突变的源流。然而本研究总体样本较少，需要积累更多病例资料，以探讨Hb G-Taipei突变与缺铁及其他血红蛋白病的相互影响，为血红蛋白疾病诊治和防控提供更多的实验证据。