14 型副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其致病性检测

王玲彩，王 青，王晓斐，董萌萌，孙亚伟，杭柏林，胡建和，徐彦召

（河南科技学院动物科技学院，河南 新乡 453003）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）是巴斯德氏杆菌科的革兰氏阴性细菌，呈小短杆至长丝状，是引起猪格拉瑟氏病的病原，主要存在于猪的上呼吸道，可通过直接接触、空气和污染物传播[1]。该病原菌主要危害1 月龄～4 月龄的仔猪和保育猪，且该菌为条件性致病菌，常在猪群免疫力低下时侵入机体，尤其在猪群发生猪繁殖与呼吸综合征、圆环病毒感染时更易感染该菌，进而引发猪群多发性浆液性炎、关节炎和脑膜炎等，临床症状多为呼吸困难、发热、关节肿大、共济失调等，一旦感染，会给猪场造成严重的经济损失[2-3]。

HPS 有多个血清型，目前已确定的有15 个血清型，另外还有一部分血清型尚未确定，将其归为不可分型（NT）[4]。HPS 在多个国家和地区均有发生，且不同地区所流行的血清型也不同，我国主要流行4、5、12、13 和14 型HPS，其中14 型为强毒力菌株之一[5-6]。近年来，由于饲养密度过大、用药不当等原因使猪群整体免疫力下降，HPS 病的易感率和病死率都呈上升的趋势。此外，带菌猪和慢性感染猪使得病原菌长期存在，给健康猪群也带来严重的威胁[7]。HPS 已经成为危害养殖业的重要病原菌之一。因此，对HPS 病的防治显得尤为重要。本实验对河南省焦作市某猪场疑似HPS 感染的发病猪进行了病原菌的分离与鉴定、血清型鉴定、药敏试验以及动物致病性试验，为该病的治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料与实验动物病料采自河南省焦作市某规模化养猪场疑似HPS感染病猪的心包液、关节液、肺脏、脾脏、脑组织等共10 份。体质量为18 g～20 g BALB/c 小鼠，购自郑州大学实验动物中心。

1.2 主要试剂与菌株烟酰胺腺嘌呤二苷酸（NAD）购自北京索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆液体培养基（TSB）购自青岛高科技工业园区海博生物技术有限公司；2×Taq PCR Master Mix 酶、DNA Marker 均购自宝生物工程（大连）有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。金黄色葡萄球菌（ATCC25923）由河南科技学院预防兽医学实验室保存。

1.3 引物设计参考文献[8]，设计HPS 16S rRNA基因（M75065）的特异性鉴定引物：上游引物F：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'/下游引物R：5'-G GCTTCGTCACCCTCTGT-3'，预期扩增片段为821 bp。根据Howell 等[9]和Jia 等[10]的研究，并结合我国当前流行的HPS 血清型，设计用于鉴定该猪场分离菌株血清型的引物（表1）。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 细菌的分离纯化、形态学观察及卫星试验于超净工作台中将采集的病猪的心包液、关节液、肺脏、脾脏、脑组织分别接种于TSA 琼脂平板（含5% 胎牛血清与1%NAD），37 ℃培养24 h～36 h。无菌挑取针尖大小、光滑透明的露珠状可疑菌落经革兰氏染色，在光学显微镜下观察，同时挑取镜检可疑的菌落，再次接种于TSA 琼脂平板上纯化培养后，挑取菌落于TSB 液体培养基中培养至对数生长期，离心后收集菌体，经2.5%戊二醛固定、不同浓度乙醇脱水、叔丁醇干燥、喷金等处理，于扫描电子显微镜下观察细菌的形态。将分离菌株于TSA 琼脂平板上划线培养，次日挑取单克隆于TSB 液体培养基中培养至对数生长期，无菌条件下用接种环沾取对数生长期的菌液水平划线于绵羊鲜血琼脂平板上，再将金黄色葡萄球菌（ATCC25923）于分离菌株垂直方向划线，于37 ℃培养24 h～36 h，观察是否出现卫星生长现象。

表1 HPS 血清型鉴定用引物Table 1 Primers for HPS serotype identification

1.5 分离菌株16S rRNA 的PCR 鉴定挑取1.4 中已纯化的分离菌株分别接种于TSB 液体培养基（含5%胎牛血清与1%NAD）中，37 ℃、180 r/min 过夜培养。以培养菌菌液为模板，以1.3 的HPS 16S rRNA基因的特异性鉴定引物进行PCR 扩增。PCR 反应程序为：95 ℃3 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃45 s，共30 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并测序。经Blast 软件对该基因序列与GenBank 中参考株相应基因序列序列比对并分析。

1.6 分离菌株血清型鉴定及其funAB基因同源性分析和系统进化树的构建参考Howell 等[9]和Jia 等[10]建立的多重PCR方法，以分离菌株菌液为模板，按照表1 的引物进行多重PCR 扩增。PCR 反应程序与1.5 相同。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测。随后以分离菌株的菌液为模板，采用HPS14F/HPS14R 引物（表1）扩增其funAB 基因，PCR 产物纯化回收后，由生工生物工程（上海）技术服务有限公司测序鉴定。将所测得的分离菌株funAB 基因序列与NCBI GenBank 中其它HPS 参考株的funAB 基因序列采用DNAstar Megalign软件进行同源性分析并构建该基因的系统进化树。

1.7 分离菌株的药敏试验无菌条件下，采用KB纸片法对分离菌株进行20 种药物的药敏试验，测量抑菌圈的大小，参照美国CLSI 推荐的判定方法，根据抑菌圈的直径（Φ）大小判定其对药物的敏感性：Φ≥20 mm 为敏感、15 mm≤Φ＜20 mm 为中介耐药、Φ＜15 mm 为耐药[11]。

1.8 分离菌株的致病性试验参照文献[12-13]，将30 只BALB/c 小鼠随机分为6 组，每组5 只，其中5组为感染组，1 组为PBS 对照组。对分离菌计数后，将不同浓度菌液分别经腹腔注射于5 组实验组小鼠，0.4 mL/只（浓度分别为2×109cfu/mL、1×109cfu/mL、5×108cfu/mL、2.5×108cfu/mL、1.25×108cfu/mL）。观察小鼠的临床症状，并对死亡小鼠剖检，同时采集死亡小鼠心、肺、脑、肝、脾、腹水等组织样品分别涂布于TSA 固体培养基，置于37 ℃培养后观察菌落形态，并按照1.5 方法对小鼠病变组织中分离的细菌进行PCR 鉴定。

2 结 果

2.1 细菌的分离纯化、形态观察及卫星试验结果将病料样品接种于TSA 琼脂平板（含5%胎牛血清与1%NAD），37 ℃培养24 h 后，可见4 株针尖大小、光滑透明的露珠状菌落，并将该4 株单个菌落涂布于载玻片上经革兰氏染色后在光学显微镜下观察，可见红色杆状革兰氏阴性菌（图1A）；将分离纯化的细菌经扫描电子显微镜观察，结果显示菌体呈短杆、长杆状，这与文献[14～15]中结果一致（图1B）。对分离菌株进行卫星试验，离金黄色葡萄球菌（b）菌苔越近的分离株菌落（a）生长越好，而离金黄色葡萄球菌越远的分离株菌落（a）越小，甚至不生长，呈现卫星生长现象（图1C）。上述结果表明，4株分离菌形态均与HPS 一致。

2.2 分离菌株的PCR 鉴定结果分别以2.1 中筛选得到的4 株疑似HPS 菌株的培养液为模板，以F/R为引物PCR 扩增其16S rRNA 基因。结果显示，4 株分离菌在约800 bp 处均有目的条带，且与预期相符（图2）。结果表明，4 株分离菌均为HPS，将其分别命名为JZ1～JZ4。

图1 分离菌株的形态学鉴定结果Fig.1 Morphology of the isolates

图2 分离菌株的PCR 鉴定结果Fig.2 PCR identification of the isolates

2.3 分离菌株的血清型鉴定及其funAB基因的同源性及进化树分析结果以2.2 中鉴定为HPS 的4 株菌液为模板，采用表1 中引物，经多重PCR 方法鉴定分离菌株的血清型。结果显示，分离菌株在约730 bp处均有目的条带（funAB 基因），且与预期相符（图3）。随后对扩增的PCR 产物测序并用Blast 软件进行比对，结果显示分离菌funAB 基因均与GenBank中14 型HPS菌株IA-84-22113（KC795520.1）相应基因序列的同源性为100%，由此证明分离到的4 株HPS均为同一菌株，将其统一命名为JZ-2019；基于funAB 基因序列对分离菌株JZ-2019 构建系统进化树，结果显示JZ-2019 株与14 型HPS IA-84-22113株聚为一支，而与血清4、5、13、15 型HPS 不在同一分支（图4），上述结果进一步表明分离菌株JZ-2019 确为14 型HPS。

图3 分离菌株的多重PCR 鉴定结果Fig.3 Serotyping PCR identification of the isolates

图4 分离菌株JZ-2019 funAB 基因的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of funAB gene of the isolate JZ-2019

2.4 分离菌株的药敏试验结果本试验选用临床常用20 种药物对分离菌株JZ-2019 进行了药敏试验。结果显示，JZ-2019 株对β-内酰胺类、大环内酯类以及氨基糖苷类药物敏感，其中对大环内酯类的哌拉西林、头孢曲松最为敏感，对氨基糖苷类的庆大霉素、新霉素、丁胺卡那以及头孢菌素类头孢拉定为中介耐药，对青霉素类药物苯唑西林耐药（表2）。结果表明，JZ-2019 株对大多数的抗菌药物均较敏感，可以根据药敏试验结果选择最佳的药物以达到较好的治疗目的。

表2 分离菌株JZ-2019 的药敏试验结果Table 2 Drug sensitivity test results of the isolate JZ-2019

2.5 分离菌株的致病性试验结果将JZ-2019 株培养至对数生长期后，采用腹腔注射的方法对小鼠进行致病性试验。结果显示，5组小鼠在感染后3 h均出现精神萎靡、背毛不整、扎堆、呼吸急促等症状，12 h 后出现死亡，其中以接种浓度为2×109cfu/mL与1×109cfu/mL JZ-2019 株的两组小鼠症状最为明显，且全部死亡；其余3 组小鼠随着接种浓度的降低其症状有所减轻，死亡数量也减少；而对照组小鼠未出现明显症状。将死亡小鼠在无菌条件下剖检，结果显示其肝脏、脾脏出血肿胀；肠管胀气，呈透明状；心脏、肺脏均有出血；脑组织充血水肿，大脑回路不清晰。用无菌接种环沾取死亡小鼠心、肺、脑、肝、脾、腹水分别划线于TSA 固体培养基，置于37 ℃培养36 h 后培养基上均长出菌落，无菌挑取呈透明、针尖大小、露珠状可疑菌落于TSB 液体培养基中培养，并以培养的菌液作为模板进行PCR 鉴定。结果显示，仅死亡小鼠的脑、腹水扩增出与JZ-2019 株大小一致的目的条带，其余组织样品并未出现扩增条带（图5）。结果表明，本研究分离到的JZ-2019 株对小鼠具有一定的致病性，且其能够透过血脑屏障引起小鼠脑部感染。

图5 死亡小鼠组织样品的PCR 鉴定结果Fig.5 PCR identification of the bacteria isolated from the tissue samples of dead mice

3 讨 论

HPS 广泛存在于猪的上呼吸道，与猪的自身菌群构成正常菌群，但在猪遇到饲养管理不当、长途运输、天气骤变等应激因素时则极易引起HPS 病的暴发。而且HPS 是一种条件性病原菌，当猪感染其它细菌或病毒时，HPS 便会与其他病原混合感染，使猪的病情更加复杂、严重，给其病情的确诊和防治都带来困难，一旦诊治不当，将导致猪群疫病大面积暴发，给猪场造成严重的经济损失[16-17]。目前，鉴别HPS 的主要方法有染色镜检、卫星生长现象以及PCR。

由于HPS 生长需要促生长因子、血清等比较苛刻的培养条件，而且必须在采集病料12 h 内分离该菌，否则将会降低其分离率。本实验采用含5%胎牛血清与1%NAD 的TSA 琼脂平板对采集的病料样品进行细菌的分离，并通过染色镜检、电子显微镜观察以及卫星生长现象初步判断分离菌株。同时，采用鉴定引物对其16S rRNA 基因进行PCR 扩增，结果证明分离到的细菌确为HPS。

HPS 的血清型众多，多采用琼脂扩散试验对其分型，但该方法需要多种HPS 阳性血清，价格较为昂贵，试验操作要求较高，且试验结果容易受外界条件干扰。本实验通过参考Howell 等[9]和Jia 等[10]的研究，并结合我国当前流行的血清型，合成HPS 各个血清型的鉴定引物，进行多重PCR 扩增，实现了对多个血清型HPS 菌株的鉴定，与琼脂扩散试验分型法相比，该法有操作简便、价格低廉且不易受外界因素干扰的特点[18]。本实验又对多重PCR 扩增产物funAB 基因测序，分析其与其他HPS 参考株该基因序列的同源性并构建该基因的进化树。结果进一步表明本研究得到一株14 型HPS，为多重PCR 鉴定HPS 血清型提供了一定的实验依据。

目前对HPS 病主要通过药物和接种疫苗来防控。临床上，虽然接种疫苗对防控该病起到一定的作用，但由于HPS 的血清型众多，不同血清型之间无交叉保护或交叉保护较差，且不同地区感染的血清型也不同，因此，完全利用疫苗防控该病具有一定的难度[19]。实际生产中，通常还是采用抗生素防治HPS 病。该方法见效快，且易于饲养人员操作，但若抗生素使用不当则极易造成细菌耐药和药物残留。因此，如何选择敏感合理的药物来防治该病就显得尤为重要。本实验采用药敏试验筛选出JZ-2019 分离株敏感的药物，并以此为依据，为该养殖场制定合理的治疗程序，有效的控制了疫情。

HPS 因血清型不同，各菌株的致病性也不同，近年来不断有关于不同血清型HPS 致病性的研究，但关于14 型HPS 致病性的研究还较少。本实验采用小鼠检测JZ-2019 分离株的致病性，结果显示该分离株确实有很强的致病性，感染组小鼠死亡率很高。剖检结果显示感染组小鼠多器官损伤，并在死亡小鼠脑组织和腹水中分离到感染小鼠的分离菌株JZ-2019，这也证实了HPS 能透过血脑屏障引起脑部炎症。本研究为14 型HPS 致病性的研究提供了参考依据。