猪源抗菌肽PMAP-23 的改造及其活性测定

刘志新，沈腾飞，蔡开蕊，王 臣

（河南科技大学兽医生物工程重点实验室，河南 洛阳 471023）

抗菌肽（Antibacterial peptide）原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2 ku～7 ku，由20 aa～60 aa 残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌性等特点[1]。世界上第一个被发现的抗菌肽是1980 年由瑞典科学家Boman 等经注射阴沟肠杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的多肽，命名为Cecropins[2]。天然抗菌肽与传统抗生素作用机制不同，其不易诱导机体产生耐药性。虽然有很多其它抗生素无法比拟的优势，但其也有缺陷。某些天然抗菌肽在杀菌的同时具有溶血性，还有一些抗菌肽本身具有毒性，无法应用于临床治疗。因此对抗菌肽进行改造已成为研究热点。目前对抗菌肽改造的方案主要是分析天然抗菌肽的生化性质，根据已知影响活性的因素，设计新的抗菌肽，或者通过比较已知抗菌肽的结构，找出保守序列，筛选出具有优良抗菌活性的新的抗菌肽[3]。1994 年Zanetti 发现猪源抗菌肽PMAP-23 作为一种新型强效抗菌剂[4]，具有较强抗菌活性。抗菌肽PMAP-23 氨基酸序列为RIIDLLWRVRRPQKPKFVTVWVR，分子量为2 962.63 Da，抗菌肽PMAP-23 二级结构首尾含α-螺旋，中间以PXXP 铰链结构相连[5]，同时富含精氨酸（R），带有正电荷的精氨酸（R）和赖氨酸（K）可以吸附于表面带有负电荷的细菌细胞膜，N 端的基本结构单元构成了双侧的两亲性的α-螺旋结构，亲水面在细胞膜外，疏水面浸润于细胞膜，C 端的基本结构单元具有亲脂性，能够插入细胞内使细胞破裂[6]，从而杀死细菌。

本研究根据抗菌肽PMAP-23 的作用机理和氨基酸组成，同时根据其杀菌特点，设计并人工合成一种新型抗菌肽PMAP-23LR，通过测定其对几种常见菌的抑菌活性及最小抑菌浓度（MIC），评价其体外抗菌活性、酸碱稳定性、热稳定性；同时建立鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠模型，研究PMAP-23LR 的体内抗菌活性，为临床上设计更加有效的猪源抗菌肽提供实验和参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、抗菌肽及实验动物猪霍乱沙门菌SLC78-1（G-）、金黄色葡萄球菌SA25923（G+）、鼠伤寒沙门菌SL1344（G-）、禽巴氏杆菌C48-3（G-）、产肠毒素性大肠杆菌7915（G-）均由本实验室提供。新型猪源抗菌肽PMAP-23LR 和猪源抗菌肽PMAP-23均由上海楚肽生物有限公司采用固相合成法合成，纯度大于95%，含抗菌肽的药敏片由本实验室参照常规方法制备保存。2 只8 周龄的海兰褐商品鸡购自洛阳现代禽业有限公司。110 只6 周龄～8 周龄BALB/c 小鼠购自河南省动物实验中心。

1.2 PMAP-23LR 的分子设计根据抗菌肽PMAP-23 的氨基酸组成特点，同时依据PMAP-23 的作用机理，将PMAP-23 N端α-螺旋亲水面第5位L（亮氨酸）改为带有正电荷的R（精氨酸）（图1），构建PMAP-23LR，替换的精氨酸以斜体表示，氨基酸序列为RIIDRLWRVRRPQKPKFVTVWVR。 抗 菌 肽PMAP-23LR 的分子量为3 005.66 Da。

图1 PMAP-23 前端α-螺旋投影及改造设计Fig.1 Design and modification of alpha helix projection of PMAP-23 front-end

1.3 PMAP-23LR 及PMAP-23 抑菌活性测定采用标准纸片法测定两种抗菌肽的体外抑菌活性[7]，以猪霍乱沙门菌SLC78-1（G-）、金黄色葡萄球菌SA25923（G+）、鼠伤寒沙门菌1344（G-）、禽巴氏杆菌C48-3（G-）、产肠毒素性大肠杆菌7915（G-）为试验菌株，分别将5 种细菌悬浮液（OD600nm=1.0～1.2）0.2 mL 与LB 固体培养基25 mL 混匀后铺平板，待其凝固后分别用含有PMAP-23LR 和PMAP-23 制成的药纸片贴于同一细菌培养皿上，药敏片含药量为15 μg，37 ℃培养过夜，然后测量其抑菌圈直径。

1.4 PMAP-23LR 及PMAP-23 的MIC 测定采用液体生长抑制法测定PMAP-23LR 和PMAP-23 对上述5 种细菌的MIC。将对数生长期的菌液用LB 培养基稀释至106cfu/mL，取50 μL 加到96 孔培养板中，分别加入不同浓度的PMAP-23LR 或PMAP-23（浓度分别为100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.12 μg/mL、1.56 μg/mL、0.78 μg/mL、0.39 μg/mL、0.20 μg/mL）的溶液50 μL，将细菌培养板于37 ℃孵育16 h，采用分光光度计测量OD600nm值。

1.5 PMAP-23LR 及PMAP-23 的酸碱稳定性测定配 制pH2～pH12 的PBS 缓 冲 液，将PMAP-23LR 和PMAP-23 分别用不同pH 值的缓冲液处理，同时用中性PBS 缓冲液处理的抗菌肽作为对照，以金黄色葡萄球菌为受试菌，进行抑菌试验，药敏片含药量为15 μg，方法同1.3 测量抑菌圈大小，绘制抑菌圈变化曲线。

1.6 PMAP-23LR 及PMAP-23 的热稳定性测定将PMAP-23LR 和PMAP-23 分别沸水浴5 min、15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min，取水浴过后的抗菌肽制作药敏片，再按1.3 进行抑菌试验，药敏片含药量为15 μg，测量其对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径大小，同时设置未加热处理组为对照组，绘制抑菌圈变化曲线。

1.7 PMAP-23LR 及PMAP-23 的溶血活性测定依照Ma 等方法[8]，收集健康的鸡红细胞，配制1%红细胞悬液；在96 孔板中的每行第1～11 号孔内加入50 μL PBS。分别将PMAP-23LR 及PMAP-23 各50 μL（1 mg/mL）加入到第1 号孔内，充分混匀，然后吸取50 μL 加入到第2 号孔内，充分混匀，依次类推，直到第10 号孔，混匀后吸取50 μL，弃去；加50 μL红细胞悬液到96 孔板的第1 至12 号孔中，第12 号孔加入50 μL 0.2%Triton X-100，混匀。将第11 号孔作为阴性对照，其中包括50 μL PBS 和50 μL 红细胞悬液；第12 号孔为阳性对照，其中包括50 μL 红细胞悬液和50 μL 0.2% Triton X-100；37 ℃孵育1 h，1000 r/min 4 ℃条件下离心5 min；吸取上清，加入到新的96 孔板中，用酶标仪测定OD600nm值；溶血活性根据下面公式进行计算：

溶血率=（样品OD600nm值-阴性对照OD600nm值）/（阳性对照OD600nm值-阴性对照OD600nm值）

将引起5%溶血活性对应肽的浓度定义为最小溶血浓度（Minimal hemolytic concentration，MHC）。

1.8 PMAP-23LR 及PMAP-23 对感染鼠伤寒沙门菌小鼠的治疗试验

1.8.1 鼠伤寒沙门菌最佳感染剂量的确定 参照朱春玲等方法[9]，将鼠伤寒沙门菌标准株接种于LB 培养板，培养24 h 后挑选典型菌落，接种LB 液体培养基，37 ℃培养18 h，将菌液接种鸡进行细菌复壮后制备菌液，同时测定细菌浓度。将计数好的试验 用 菌（4.6×1010cfu/mL）分 别 进 行1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000 和1∶10 000 稀释后[10]，经腹腔注射途径感染小鼠，0.1 mL/只，每个浓度5 只小鼠，同时以注射生理盐水的小鼠作为对照组。感染后连续观察，记录小鼠死亡情况。以小鼠全部死亡的最小剂量（LD100）作为该菌的最佳感染剂量。

1.8.2 PMAP-23LR 和PMAP-23 对感染鼠伤寒沙门菌的小鼠治疗实验 将80 只小鼠，随机均分为4 组，20 只/组，经腹腔注射最佳感染剂量的鼠伤寒沙门菌，待小鼠出现典型症状后，各实验组小鼠分别饲喂PMAP-23 或PMAP-23LR（0.2 mg/d），连续饲喂5 d，同时以PBS 作阴性对照组（感染后饲喂PBS），以不感染不给药组作为空白对照组。每天观察并记录各组小鼠临床症状和死亡数量，计算死亡率，同时第5 d 制备各组小鼠肺脏和肝脏病理切片，观察病理变化。

2 结 果

2.1 PMAP-23LR 和PMAP-23 的抑菌活性测定结果通过体外药敏试验测定PMAP-23 与PMAP-23LR的抑菌活性结果显示，PMAP-23LR 相对于PMAP-23对猪霍乱沙门菌SLC78-1（G-）抑菌圈由12 mm 变为14 mm，抑菌圈增加2 mm；对金黄色葡萄球菌SA25923（G+）抑菌圈由26 mm变为29 mm，抑菌圈增加3 mm；对鼠伤寒沙门菌SL1344（G-）抑菌圈由16 mm 变为21 mm，抑菌圈增加5 mm；对禽巴氏杆菌（G-）C48-3抑菌圈由16 mm 变为19 mm，抑菌圈增加3 mm；对产肠毒素性大肠杆菌7915（G-）抑菌圈由10 mm 变为14 mm，抑菌圈增加4 mm（表1），结果表明PMAP-23LR 的抑菌效果要强于PMAP-23。

2.2 PMAP-23LR 及PMAP-23 的MIC 测定结果经微量稀释法检测两种抗菌肽对不同菌的MIC 测定结果显示，PMAP-23LR 相对于PMAP-23，对猪霍乱沙门菌C78-1（G-）的MIC 并无变化；对金黄色葡萄球菌25923（G+）、鼠伤寒沙门菌SL1344（G-）、禽巴氏杆菌C48-3（G-）、产肠毒素性大肠杆菌7915（G-）的MIC 降低一个浓度梯度（表2），结果表明PMAP-23LR 对部分菌株的抑菌能力要强于PMAP-23。

表1 PMAP-23LR 与PMAP-23 对5 种菌 抑菌圈直径Table 1 Inhibitory zone diameter of new porcine antibacterial peptides PMAP-23LR and PMAP-23 against five kinds of bacteria

表2 PMAP-23LR 与PMAP-23 对5 种 细 菌 的MICTable 2 MICs of novel porcine antibacterial peptides PMAP-23LR and PMAP-23 against five kinds of bacteria

2.3 PMAP-23LR 及PMAP-23 的稳定性测定结果通过检测不同酸碱试剂处理的两种抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌圈的变化，分析其酸碱稳定性，结果显示，PMAP-23 在pH7 时活性开始下降，pH12 时活性下降明显；PMAP-23LR 在pH12 时活性开始明显下降。pH12 时，PMAP-23LR 活性高于PMAP-23。酸性条件下两种抗菌肽对金黄色葡萄球菌抗性并没有影响，强碱性条件下PMAP-23LR 对金黄色葡萄球菌抗菌活性比PMAP-23 更加稳定（图2A、2B），表明在酸性条件下两种抗菌肽的稳定性均无发生变化，碱性条件下PMAP-23LR比PMAP-23的稳定性更强。

PMAP-23LR 和PMAP-23 经沸水浴处理，通过检测其对金黄色葡萄球菌抑菌圈的变化，分析其热稳定性，PMAP-23在加热煮沸后活性下降，在60 min前活性下降幅度较小；PMAP-23LR 在加热煮沸后活性有所下降，在75 min前活性下降幅度较小，且煮沸后2 h 仍然具有较高的抑菌活性（图2C、2D），表明抗菌肽PMAP-23LR 的热稳定性增加。

2.4 PMAP-23LR 及PMAP-23 的溶血活性测定结果取不同浓度的PMAP-23、PMAP-23LR 处理过的红细胞悬浮液，吸取上清，检测1～12 号孔OD600nm值。结果显示，阴性对照组OD600nm值为0.052，阳性对照组OD600nm值为0.43，2 μg/mL～1 mg/mL 的PMAP-23 组和PMAP-23LR 组OD600nm值在0.049～0.053 之间，溶血率均低于5%，表明两组抗菌肽均不能使鸡红细胞发生溶血。

2.5 PMAP-23LR 及PMAP-23 对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠模型的治疗试验结果

2.5.1 鼠伤寒沙门氏菌最小致死剂量的确定 将小鼠经腹腔注射后，记录小鼠死亡情况，结果显示分别腹腔注射0.1 mL 浓度为4.6×1010cfu/mL、4.6×109cfu/mL 和4.6×108cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌小鼠5 d内全部死亡，腹腔注射0.1 mL 4.6×107cfu/mL 和4.6×106cfu/mL鼠伤寒沙门氏菌的小鼠5 d内未全部死亡，鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的LD100量为4.6×108cfu/mL，表明试验用菌的最佳感染剂量为4.6×108cfu/mL。

图2 PMAP-23LR 及PMAP-23 稳定性测定曲线Fig.2 Stability determination of antimicrobial peptides

2.5.2 临床症状和死亡率 抗菌肽治疗期间，每天观察各组小鼠的临床症状及死亡情况，结果见表3，空白对照组小鼠食欲，精神正常并全部存活，PBS对照组在5 d内全部死亡；PMAP-23实验组小鼠在5 d内死亡13只，死亡率为65%，剩余小鼠精神沉郁，进食量少；PMAP-23LR组小鼠死亡11只，小鼠死亡率为55%，存活小鼠被毛粗糙，进食量恢复；PMAP-23 组、PMAP-23LR组与PBS 组相比，死亡率显著降低；PMAP-23 组、PMAP-23LR组小鼠在感染后1 d～5 d死亡率相比差异显著（p＜0.05），显示PMAP-23LR具有良好的治疗效果。

2.5.3 组织病理学观察结果 通过制作不同组别小鼠的肺脏和肝脏病理切片，观察结果显示，空白对照组小鼠肺脏中无炎症；PBS 对照组小鼠肺组织间质弥漫性炎性细胞浸润，炎症病变呈片状分布，累及范围大于30%肺叶组织，支气管及血管周围炎症明显，成纤维细胞中度增生，间隔中度增宽，并伴有肺泡腔明显缩小；PMAP-23 组小鼠局部肺组织间质可见少量红细胞，局部肺泡腔或细支气管腔内少量纤维蛋白渗出；PMAP-23LR 组小鼠肺泡腔或细支气管腔内未见纤维蛋白渗出，局部肺间质可见少量散在淋巴细胞。空白对照组小鼠肝脏无病变；PBS 对照组小鼠肝组织中肝小叶结构轮廓消失，出血严重，肝细胞形态不规则，管区周围大部分肝细胞肿胀，空泡变性明显，肝窦隙内弥漫性炎细胞浸润；PMAP-23 组小鼠汇管区周围炎症明显，肝组织炎性细胞浸润，无出血，肝细胞形态不规则；PMAP-23LR 组小鼠少量炎性细胞，肝窦隙内弥漫性炎性细胞浸润，假小叶间纤维间隔宽窄不一（图3），表明两组抗菌肽在小鼠体内对于肺脏和肝脏均具有良好的治疗效果，对比两组抗菌肽在肝脏和肺脏细胞的形态，其中PMAP-23LR 的治疗效果要优于PMAP-23。

图3 各组小鼠肺脏和肝脏组织病理变化（HE 染色）Fig.3 Pathological changes of lung and liver tissues(HE staining)in each group of mice

3 讨 论

由于细菌耐药性的产生，寻找新的抗生素替代品尤为重要。研究发现，从生物体内提取的抗菌肽具有广谱抗菌活性。抗菌肽主要通过表面的正电荷与微生物细胞膜表面的负电荷相互吸附发挥抗菌作用，导致细胞膜破坏，因此，抗菌肽不易产生耐药性。抗菌肽的阳离子性和两亲性是其发挥抗菌活性的重要物理基础。根据抗菌肽特点，用带正电荷的氨基酸残基替换亲水面天然抗菌肽氨基酸残基，获得了在酸性条件下膜裂解活性较高的多肽[11]，在维持抗菌肽保守氨基酸不变的情况下，在适当位置改变或置换一些氨基酸，能够提高天然抗菌肽的抗菌作用[12]。

PMAP-23 是Cathelicidins 家族中一类富含精氨酸的多肽[13]，是典型的具有两亲性抗菌肽的代表。对其增加正电荷的研究尚未见报道。本研究将PMAP-23 二级结构中前端螺旋的第5 位氨基酸亮氨酸（L）改为亲水带正电的氨基酸精氨酸（R），形成了PMAP-23LR。PMAP-23LR 增加了PMAP-23 的正电荷数，同时增加了前段α-螺旋亲水面的亲水性，然后对PMAP-23LR 和PMAP-23 进行体外活性检测，发现PMAP-23LR 对猪霍乱沙门菌抗菌活性与原肽相比MIC 没有变化，但对鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、禽巴氏杆菌和产肠毒素性大肠杆菌的MIC 降低了。

抗菌肽应具有实际应用价值的理化特性，因此本研究测定了抗菌肽的稳定性和溶血活性，发现PMAP-23LR 不仅在酸性溶液中保持抗菌活性，而且还抑制碱性溶液中的金黄色葡萄球菌的生长（pH8～pH11）；在热稳定性实验中PMAP-23LR 在煮沸2 h后仍具有抗菌活性，这可能是因为R 是碱性氨基酸，我们将L 替换成R 之后，使碱性氨基酸比例升高，提高了原肽的稳定性，这与Leite 的研究一致[14]，增加抗菌肽中碱性氨基酸的数量可提高其稳定性。抗菌肽改造后并没有使鸡红细胞发生溶血，即PMAP-23LR 没有溶血活性。

PMAP-23LR 在体外具有良好的抗菌活性，对鼠伤寒沙门菌的抑菌活性较强，为了检测PMAP-23LR在体内能否表现出抗菌活性，用鼠伤寒沙门菌1344感染小鼠，用PMAP-23LR 或PMAP-23 进行治疗，PMAP-23 组、PMAP-23LR 组小鼠在感染后1 d～5 d 死亡率差异显著（p＜0.05），病理组织学变化结果显示，PMAP-23组小鼠肺脏炎性细胞浸润明显，细支气管腔内可见少量纤维渗出液，肝细胞形态不规则，汇管区周围炎症明显，而PMAP-23LR 组小鼠肺和肝脏组织未见纤维蛋白液渗出，炎性细胞浸润几乎消除。体内治疗模型结果表明，PMAP-23LR对小鼠感染鼠伤寒沙门菌有较好的治疗效果。

本研究通过测定两组抗菌肽体外和体内抑菌活性及生物活性，发现增加抗菌肽PMAP-23 亲水面亲水性可以增加抗菌肽的抗菌活性，同时可以增加其稳定性，也未出现细胞毒性，为后期开发新型猪源抗菌肽PMAP-23 提供了实验依据。