重组鸭γ-干扰素的表达与抗病毒活性分析

王永娟，郭艳丽，崔平福，张紫菡，陈梓岳，陆 辉，朱善元*

（1. 江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏 泰州 225300；2. 南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210000；3. 泰州海关，江苏 泰州 225300）

干扰素（Interferon，IFN）是干扰病毒复制的细胞因子[1]，IFN-γ 为IFN-II[2]，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学功能[3]。早期干扰素的制备采用生物提取法，优点是天然、生物活性较高，但具有成本高、生产规模小、效率低等缺点[4]。随着分子生物学技术的快速发展，现多采用基因工程技术生产IFN。与生物提取法相比，重组IFN 具有纯度高、成本低、便于规模化生产等优点，目前已有其基因工程产品应用于临床疾病治疗和疫苗的免疫佐剂[5-6]。

近年来，部分水禽病毒性疾病仍缺乏有效的治疗手段，病毒性疾病严重困扰并制约着水禽产业体系的健康发展[7]。如果大量使用化学药物容易造成耐药性，甚至由于在体内残留会威胁人类的健康。而IFN 是具有强大生物学功能的细胞因子，其广谱的抗病毒作用尤为突出，IFN 在抗病毒方面的应用积极响应了“减抗替抗，绿色用药”的号召，具有广阔的应用前景，因此研发广谱、高效、安全的重组禽类IFN 尤为重要。基于此，本研究构建并表达重组类弹性多肽蛋白-鸭INF-γ（ELP-DuIFNγ），并分析其在体内外的抗病毒活性，为重组鸭γ-干扰素（DuIFNγ）制剂研发及应用奠定基础，为进一步临床试验提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料限制性内切酶Sac I 和Xho I、Taq DNA 聚合酶购自Thermo Fisher Scientific 公司；T4 DNA 连接酶、1kb DNA Marker、Prestained Protein分子量Marker 均购自Fermentas 公司；质粒小量提取试剂盒购自TaKaRa 公司；胶回收试剂盒、SDSPAGE 电泳试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、包涵体纯化试剂盒、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）感受态细胞均购自康为世纪公司；FM 培养基、DMEM 培养基、胎牛血清购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

pET30a-ELP 载体和水疱性口炎病毒（VSV）由扬州大学孙怀昌教授惠赠；鸭成纤维细胞（DEF）和犬肾细胞（MDCK）由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室保存；I 型鸭肝炎病毒（DHAV-1）由中国农科院上海兽医研究所惠赠；1 日龄的樱桃谷鸭购自泰兴市嘉益畜禽养殖有限公司。

1.2 DuIFNγ基因序列的设计合成由于鸭IFN 序列相对保守，在设计DuIFNγ 基因序列时依据大肠杆菌密码子的偏爱性，参考GenBank 已经发表的Du-IFNγ（DQ855272）进行序列优化，并在其两端引入酶切位点BamH I 和Nde I，目的基因由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并与pUC57 载体连接，构建重组质粒pUC57-DuIFNγ。

1.3 引物设计合成及重组表达质粒的构建对pET30a-ELP 载体序列的酶切位点分析，设计1 对引物：TAGAGCTCCGGCGCGCCGTGCTCTGGTTCTGCTC TGTT（Sac I）/CACTCGAGTTAGCAACGGCAACGTTTC GGAG（Xho I），引物由生工生物工程（北京）股份有限公司合成。以pUC57-DuIFNγ 为模板，PCR 扩增DuIFNγ 基因，扩增产物经Sac I 和Xho I 双酶切后利用T4 连接酶与pET30a-ELP 载体连接，构建的重组质粒经Sac I/Xho I 酶切鉴定，鉴定正确的阳性质粒由生工生物工程（北京）股份有限公司测序鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pET30a-ELP-Du-IFNγ。

1.4 重组ELP-DuIFNγ蛋白质粒（rELP-DuIFNγ）的表达与纯化将重组表达质粒pET30a-ELP-Du-IFNγ 和空载体pET30a-ELP 分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，挑取单菌落过夜活化，然后转接种至2×YT 培养基，180 r/min、37 ℃振荡培养约2 h 至菌液OD600nm为0.6，加入终浓度1 mmol/L 的IPTG，37 ℃诱导培养4 h，收集菌体，低温条件下超声破碎细菌，煮沸变性后经8%的SDS-PAGE 检测rELP-DuIFNγ 的表达。

收集上述裂解后的菌液12 000 r/min 离心15 min分离上清液，加入等体积的NaCl 溶液，使盐离子终浓度为3 mol/L，28 ℃水浴孵育10 min，盐离子处理后的混合液在28 ℃下12 000 r/min 离心15 min，弃上清，沉淀即为初步纯化的rELP-DuIFNγ。用预冷的PBS 重悬析出的重组蛋白，经8%的SDS-PAGE 分析后采用BCA 法对重组蛋白进行定量分析，0.22 μm滤器过滤除菌后保存于-80 ℃备用。

1.5 重组蛋白的抗病毒活性检测

1.5.1 VSV 的TCID50测定 将生长状态良好的MDCK和DEF 用完全培养基稀释为密度为8×104个/mL，100 μL/孔分别接种于96 孔板，待细胞长成单层后，每孔分别加入100 μL 由相应培养基10 倍倍比稀释（10-2～10-11）的VSV，每个浓度6 个重复，同时设置不加病毒的细胞对照组。置于37 ℃、5%CO2培养2 h 后弃掉细胞培养液，每孔加入100 μL 维持液继续培养，记录细胞病变（CPE）情况，直至细胞状态不再变化时，根据Read-Muench 法计算VSV 在两种细胞中的TCID50。

1.5.2 rELP-DuIFNγ 体外抗病毒活性检测 待接种于96 孔板生长状态良好的MDCK 和DEF 长成单层后，分别加入10 倍倍比稀释的纯化的rELPDuIFNγ，每孔100 μL，每个浓度4 个重复；在37 ℃、5%CO2条件下共孵育15 h 后弃掉含蛋白的培养液，接入100 TCID50的VSV，即为抗病毒实验组；同时设置蛋白对照组（只加倍比稀释的rELPDuIFNγ），病毒对照组（只加VSV）和细胞对照组（不加rELP-DuIFNγ，也不加VSV）[10-11]。培养18 h 以后开始记录CPE 的情况，以阳性对照组75%以上的细胞出现病变时，利用MTT 法对各组细胞进行染色，二甲基亚砜（DMSO）溶解紫色结晶后用酶标仪测定OD490nm值，以抗病毒试验组能保护50%细胞不发生病变的最高稀释度作为一个活性单位（U），根据Read-Muench 法计算rELP-DuIFNγ 的抗病毒活性。

1.6 rELP-DuIFNγ的体内抗病毒作用检测将18只4 日龄的樱桃谷鸭分为3 组，每组6 只，分别为感染DHAV-1 的阳性对照组、阴性对照组和抗病毒实验组。病毒感染剂量为100 LD50/只，同时抗病毒试验组按160 μg/kg 剂量给鸭子灌服rELP-DuIFNγ，48 h/次，连续3 次。观察各组鸭子的采食、粪便形态、精神状态、同时测定其体温，记录各组病死鸭的数量、发病时间，并计算存活率。

2 结 果

2.1 重组表达质粒的鉴定结果重组表达质粒pET30a-ELP-DuIFNγ 酶切鉴定结果显示，酶切得到约7 000 bp 和450 bp 的目的条带，与预期相符（图1）。进一步测序结果显示，DuIFNγ 基因序列与优化的序列同源性为100%。表明重组质粒正确构建。

图1 pET30a-ELP-DuIFNγ 的酶切鉴定Fig.1 pET30a-ELP-DuIFNγ digestion identification

2.2 rELP-DuIFNγ的表达与纯化结果重组菌pET30a-ELP-DuIFNγ/BL21 经诱导表达后进行纯化，SDS-PAGE分析表达蛋白及纯化情况。结果显示，出现与预期大小相符的目的条带，且目的蛋白主要以可溶性形式表达，而空载体对照在对应位置无该目的条带（图2）。初步纯化的重组蛋白不溶于PBS中，经包涵体纯化试剂处理后的重组蛋白纯度达90%以上。BCA法测定rELP-DuIFNγ的浓度为2.4 μg/μL。表明利用ELP的功能优势得到了高纯度、高浓度的rELP-DuIFNγ。

图2 rELP-DuIFNγ 表达及纯化的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis for the rELP-DuIFNγ expression and purification

2.3 rELP-DuIFNγ体外抗病毒活性检测结果经计算VSV 在MDCK 中的TCID50=10-6.83/0.1 mL，VSV 在DEF 中的TCID50=10-6.17/0.1 mL。10 倍倍比稀释的rELP-DuIFNγ 分 别 作 用 于MDCK 和DEF，结 果 显示，蛋白对照组（图3B、4B）未出现明显的抑制细胞生长、细胞死亡等现象，和细胞对照组（图3A、图4A）相比无显著变化；经MTT 染色法比较两组OD490nm值无显著区别（p＞0.05）。表明rELP-DuIFNγ 对MDCK与DEF均无毒副作用。

图3 rELP-DuIFNγ 在VSV/MDCK 系统中抗病毒活性检测（40×10）Fig.3 Analysis of antiviral activity of rELP-DuIFNγ in the VSV/MDCK system

采用细胞病变抑制法测定rELP-DuIFNγ 的抗病毒活性，在40×10 的荧光倒置显微镜下观察可见，抗病毒试验组（图3C、图4C）相对于病毒对照组（图3D、图4D）可以明显抑制细胞病变，具有保护细胞的作用；经MTT 染色法测得抗病毒实验组的OD490nm值显著高于病毒对照组（p＜0.05）。根据Read-Muench 法的公式计算rELP-DuIFNγ 的抗病毒活性，在VSV/MDCK 系统和VSV/DEF 系统中分别为4.17×104U/mg 和4.54×105U/mg。表 明rELP-DuIFNγ 在MDCK 和DEF 中均具有较高的抗病毒活性，且在不同受体细胞中的抗病毒活性有较大的差异。

2.4 rELP-DuIFNγ体内抗病毒作用结果感染DHAV-1 的雏鸭灌服rELP-DuIFNγ 后，观察临床症状。结果显示，感染DHAV-1 的阳性对照组6 只雏鸭在48 h 内全部出现精神沉郁、粪便稀软、嗜睡、抽搐、身体呈弩弓状等临床症状，并死亡；阴性对照组雏鸭体温正常、精神状态、生长状况良好；抗病毒试验组中1 只雏鸭在感染DHAV-1 72 h 后出现临床症状并死亡，感染6 d 时另外1 只雏鸭出现临床症状，其余雏鸭均精神状态良好。经统计计算阳性组、阴性组、抗病毒实验组雏鸭的存活率分别为：0、100%、66.67%（表1）。上述结果表明，rELPDuIFNγ 可以抵抗DHAV-1 对雏鸭的感染，并延缓发病时间，降低发病率。

图4 rELP-DuIFNγ 在VSV/DEF 系统中抗病毒活性检测（40×10）Fig.4 Analysis of antiviral activity of rELP-DuIFNγ in the VSV/DEF system

表1 rELP-DuIFNγ 体内抗病毒结果Table 1 Antiviral activity analysis of rELP-DuIFNγ in vivo

3 讨 论

有研究显示，重组DuIFNγ 大多数为组氨酸标签融合蛋白，在大肠杆菌中以包涵体形式表达，需要经过变性、复性处理后再通过亲和层析法进行纯化[8]，操作过程繁琐、成本较高且下游工程难以实现规模化。而ELP 是一类根据体内弹性蛋白重复序列合成的五肽聚合物[9]，具有温度敏感的可逆相变特性，即在临界温度以下时以可溶形式溶解在缓冲液中，到达临界温度时开始集聚，从溶液中析出，可作为纯化标签帮助实现外源蛋白的纯化[10]。利用ELP 标签纯化蛋白时仅需要加入NaCl 溶液并调节温度便可以得到纯的rELP-DuIFNγ，使得纯化过程简便、成本降低且便于规模化。同时也有文献证明ELP 能够增加外源蛋白的可溶性表达[11]。因此，本研究在构建重组DuIFNγ 序列时插入ELP 序列，旨在经原核表达获得可溶性的rELP-DuIFNγ，并利用ELP 的可逆相变循环特性纯化重组蛋白，结果表明纯化蛋白的纯度可达到90%以上，这一实验结果也验证了ELP 在重组IFN 的原核表达和纯化过程中的功能优势。

重组IFN 除了存在纯化难的问题，在体内半衰期较短的缺点也亟待解决。由于目前IFN 在临床应用时需要长期反复注射，因此延长IFN 的半衰期也是近年来的研究热点，目前延长IFN 体内半衰期的主要策略有聚己二醇化、与抗体Fc 片段融合表达、与血清白蛋白融合表达等[12]，而聚乙二醇化反应条件和产品质量难以控制[13]，与抗体Fc片段、血清白蛋白融合表达后仍需要通过亲和层析纯化，操作过程复杂、成本较高，也难以实现规模化。而Bidwell[14]、董文凤[15]、Kim[16]等报道ELP 可以延长蛋白半衰期，可作为药物的传送载体。因此本研究将ELP 与DuIFNγ融合表达，在雏鸭体内初步探究其抗DHAV-1 的作用，与程俊贞[17]、吴志明[18]等试验中每24 h/次给药相比较，给雏鸭每隔48 h/次灌服rELP-DuIFNγ，同样能够降低雏鸭死亡率，抗病毒效果较好。由此验证了与ELP 融合的重组IFN 较传统的重组IFN 纯化过程简单且延长了其体内的半衰期，这一实验结果为后期重组DuIFNγ制剂、疫苗佐剂的开发奠定了基础。

在构建重组序列时，ELP 与目的蛋白的氨基端或羧基端融合位置的选择主要取决于目的蛋白自身的表达量[19]。在目的蛋白表达量较高的情况下，为了减少ELP 标签对目的蛋白折叠过程的干扰，应该先翻译目的蛋白，再翻译ELP 标签，所以将目的蛋白的羧基端与ELP 标签融合较为合理；相反，在目的蛋白表达量不高的情况下，一般将目的蛋白的氨基端与ELP 标签融合，这样有助于目的蛋白的可溶性表达[20]。由于DuIFN 自身表达量低，所以本研究通过预实验摸索了ELP 分别和DuIFNγ 氨基端、羧基端融合之后的表达量，预实验结果表明：ELP 与目的蛋白氨基端融合为最优序列，rELP-DuIFNγ 表达量较高，这是本研究最终选择该重组序列的直接原因，而纯化结果和抗病毒作用也证实了这一设计具有理论和实践可行性。

本研究合成DuIFNγ 基因时与ELP 融合表达，旨在借助ELP 的功能优势，实现DuIFNγ 的高效可溶表达，简便纯化，降低生产成本，易于规模化生产，并在体内外检测其抗病毒活性，为重组DuIFN的实际应用提供新的思路，同时为研制新型、安全、高效的DuIFN 制品以及探索DuIFN 在临床防治禽类病毒性疾病的应用奠定了基础。