pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白结构的影响

吴晓娟 张佳妮 李 依 金曼芹 王晓婵 沈佳丽 吴 伟

(中南林业科技大学食品科学与工程学院；稻谷及副产物深加工国家工程实验室，长沙 410004)

米糠是糙米碾米后的副产物，约占糙米总重的10%，富含蛋白质、脂肪、膳食纤维及多种生理活性物质[1]。米糠脱脂后蛋白质质量分数高达15%～20%，是一种丰富而价廉的植物蛋白资源。米糠蛋白因其过敏性低、氨基酸组成合理、生物效价高以及潜在的功能特性(乳化性、起泡性)，可作为配料应用于饮料、酱料、肉制品、焙烤制品等多种食品[2]。鉴于米糠蛋白良好的营养价值及潜在的功能特性，目前越来越多研究聚焦于采用新的改性方法(如酸碱处理、酶处理、热处理、超声辅助等)，改变其结构与性质，拓展其潜在应用领域[3]。米糠蛋白的营养品质和功能特性与其结构特征密切相关，例如：米糠蛋白的消化特性与其氧化程度、亚基结构和表面疏水性等因素密切相关[4]；功能特性与其表面电荷、极性氨基酸、表面疏水性、分子量大小等因素密切相关[5]。pH偏移是一种操作简单、成本低廉且效果显著的改变蛋白质空间结构的方法。pH偏移处理可以在一定程度上改变蛋白质的二级结构、亚基结构、游离巯基、酪氨酸残基等结构特征[6]。近年来，部分研究还侧重于将不同的蛋白质改性方法相结合，如将pH偏移和热处理相结合，可获得更加精准的蛋白质分子柔性的调控方法[7]。pH酸性偏移结合热处理可使大豆分离蛋白的空间结构发生一定程度的展开，疏水性氨基酸残基暴露，但对于蚕豆蛋白则表现为使暴露于分子表面的疏水性氨基酸残基重新包裹于疏水核心[8,9]。鉴于pH偏移结合热处理对于不同蛋白质结构特征的影响差异较大，且目前也未见关于pH偏移结合热处理影响米糠蛋白结构特征的研究报道，本文拟研究pH酸性偏移(pH 1.5)结合温和热处理(50、60 ℃)对米糠蛋白结构特征的影响，以期获得一种简便有效的米糠蛋白结构的调控方法，为合理开发米糠蛋白资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂米糠、蛋白分子标准品(14～100 ku)、1-苯氨基萘-8-磺酸、5,5′-二硫代二硝基苯甲酸(5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)(分析纯)，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV1800紫外可见分光光度计，IRTracer-100 傅里叶变换红外光谱仪，LC-20液相色谱仪，Healthcare SE260电泳仪，F4600荧光分光光度计，Sorvall LYNX 6000高速落地离心机，FD5-4冷冻干燥机。

1.3 方法

1.3.1 制备米糠蛋白

参考吴伟等[10]方法，将100 g脱脂米糠与1 000 mL去离子水混合，用2 mol/L NaOH溶液将混合液调至pH 9.0，在40 ℃、120 r/min下水浴搅拌4 h，然后在4 ℃下离心20 min，转速为8 000 r/min。取上清液用2 mol/L HCl溶液调至pH 4.0，静置20 min，待出现明显沉淀后在4 ℃、8 000 r/min下离心15 min。水洗沉淀并在4 ℃、8 000 r/min条件下离心15 min，重复2次。随后用去离子水分散蛋白沉淀，并用2 mol/L HCl溶液调pH至7.0，最后冷冻干燥得到米糠蛋白。

1.3.2 米糠蛋白处理

1.3.3 傅里叶变换红外光谱分析

参考Liu等[11]的方法将米糠蛋白制成透明薄片，用傅里叶变换红外光谱仪进行扫描，波数范围：400～4 000 cm-1，扫描次数：64，分辨率：4 cm-1。

1.3.4 游离巯基和总巯基含量测定

将米糠蛋白配制成浓度20 mg/mL的待测蛋白溶液，溶液中蛋白质含量采用考马斯亮蓝法进行测定。参考Huang等[12]的方法，采用DTNB比色法测定米糠蛋白的游离巯基和总巯基含量。

1.3.5 分子量分布测定

将米糠蛋白配制成10 mg/mL的蛋白溶液，过孔径0.45 μm的醋酸纤维素膜，对滤液采用LC-20A高效液相色谱仪进行分析，色谱柱：TSKgel SW G4000 SWXL；检测器：Waters 996光电二极管阵列检测器；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃；流动相：0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2，含0.05 mol/L NaCl)；流速：1 mL/min。

1.3.6 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用质量分数12.5%的分离胶和4%的浓缩胶，含有0.05 mol/L Tris-0.384 mol/L甘氨酸、0.1%十二烷基硫酸钠(pH 8.3)的电极缓冲液。在烧杯中分别加入10%十二烷基硫酸钠，5 mL β-巯基乙醇，10 mL甘油，20 mg溴酚蓝，20 mL 0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，最后加水至总体积100 mL，配制成样品溶解液，再把米糠蛋白溶于样品溶解液中配成1.5 mg/mL的电泳样品。上样量10 μL，起始电流10 mA，样品进入分离胶后电流调大到25 mA。

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1.3.7 内源荧光光谱测定

将米糠蛋白用去离子水稀释成0.1 mg/mL的蛋白溶液，采用F-4600型荧光光谱仪在激发波长280 nm下扫描300～500 nm之间的发射光谱(狭缝宽度2.5，灵敏度为1)。

1.3.8 表面疏水性测定

将米糠蛋白用去离子水配制成20 mg/mL的蛋白溶液，再将其稀释为0.005～0.50 mg/mL之间5个不同浓度梯度的蛋白溶液。在试管中分别加入不同浓度的蛋白溶液4 mL和8 mmol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸溶液50 μL，在激发波长390 nm、发射波长470 nm下测定荧光强度。以蛋白质浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，米糠蛋白表面疏水指数即曲线初始阶段的斜率。

1.3.9 溶解度测定

参考Arte等[13]方法，将1.00 g米糠蛋白分散于100 mL 0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液中，在室温下磁力搅拌2 h，然后在10 000 r/min下离心20 min收集上清液，采用微量凯氏定氮法测定米糠蛋白样品的总氮含量以及上清液的可溶性氮含量，通过可溶性氮含量与样品总氮含量的百分比计算米糠蛋白的溶解度。

1.3.10 数据处理与统计分析

采用Microsoft excel 2010和Origin 7.5进行数据处理，结果用“均值±标准偏差”表示，重复3次。

2 结果与分析

2.1 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白二级结构的影响

傅里叶变换红外光谱是分析蛋白质结构变化的主要技术之一，特别是酰胺Ⅰ带(1 700～1 600 cm-1)是表征蛋白质二级结构最常用的特征频率区域。参考Sun等[14]的方法对pH 1.5偏移结合热处理的米糠蛋白去卷积酰胺I带吸收光谱进行Gaussian拟合，得到11个特征吸收峰，通过鉴定[14-16]：α-螺旋结构，1 653 cm-1；β-折叠结构，1 618、1 630、1 638、1 676、1 682、1 694 cm-1；β-转角结构，1 671 cm-1；无规卷曲结构，1 646、1 662 cm-1；氨基酸侧链，1 609 cm-1。计算得到的米糠蛋白二级结构组成如表1所示，pH酸性偏移处理对米糠蛋白中较为稳定的α-螺旋和β-折叠的相对含量影响较小，但会使部分无规卷曲和β-转角结构展开,形成氨基酸侧链。这可能是由于pH酸性偏移通常会使蛋白质处于变性与未变性之间的熔球态，保持相对稳定的二级结构，因而对米糠蛋白中的有序结构影响较小[9]；但在酸性环境下，蛋白质分子羧基发生质子化，分子间的静电斥力便会增强，会导致蛋白质分子发生一定程度的展开，这可能是造成米糠蛋白中无序结构展开形成氨基酸侧链的主要原因[17]。pH 1.5偏移结合热处理时，加热1～3 h得到的米糠蛋白β-折叠相对含量明显降低，无归卷曲相对含量明显增加，且温度越高，去折叠程度越大；当加热时间延长到5 h时，米糠蛋白发生复折叠反应。周向军等[9]在研究pH偏移结合热处理对蚕豆蛋白结构的影响时也发现，当pH 1.5偏移结合55 ℃热处理1.5 h时，蚕豆蛋白的有序结构开始向无序结构转变，但未对加热更长时间的蛋白质结构变化进行研究。付湘晋等[18]在用酸碱处理鱼肌原纤维蛋白时研究发现，蛋白质分子会因热变性而展开，随后又会通过蛋白质相互作用，包括疏水作用、氢键、—SH生成S—S键等产生聚集，这可能是pH 酸性偏移结合热处理使得米糠蛋白二级结构呈现去折叠-复折叠趋势的主要原因。

表1 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白二级结构的影响

2.2 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白游离巯基和总巯基含量的影响

巯基是影响蛋白质构象稳定性的主要侧链基团之一，对蛋白质的功能特性也具有重要影响[19]。pH 酸性偏移以及结合热处理的米糠蛋白巯基变化如表2所示，相比于未处理的米糠蛋白，pH酸性偏移以及结合热处理的米糠蛋白总巯基和游离巯基含量均显著下降。相比于单独pH酸性偏移处理的米糠蛋白，结合热处理的米糠蛋白游离巯基含量更低。耿蕊等[8]关于pH 偏移结合热处理对大豆蛋白结构影响的研究发现，游离巯基呈现类似的变化趋势。蛋白质巯基氧化是一个复杂过程，巯基通常先被自由基攻击生成亚磺酰自由基，随后再与分子氧形成硫醇自由基，然后继续氧化形成二硫键，这一阶段是可逆氧化反应，而不可逆氧化反应则进一步生成亚磺酸、磺酸等[10]。加热条件下蛋白质游离巯基更易被自由基氧化，因而，热处理加剧了米糠蛋白在酸性环境中的巯基氧化程度[20]。

表2 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白总巯基、游离巯基的影响

2.3 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白分子质量分布的影响

图1显示了pH 酸性偏移以及结合热处理对米糠蛋白分子质量分布的影响。未处理的米糠蛋白主要有2个特征吸收峰，对应保留时间分别为5.97 min和11.53 min，峰面积百分比分别为13.24%和86.76%，前者主要是蛋白质聚集体等高分子物质，后者主要是米糠蛋白及其亚基等小分子物质[8]。采用pH 1.5偏移以及结合50 ℃和60 ℃处理均会促使米糠蛋白聚集体解离，当处理时间为1 h时，保留时间5.97 min的峰面积百分比分别为0.92%、1.65%和1.83%。Jiang等[21]关于pH偏移处理大豆蛋白11S组分的研究也认为，极端pH条件下，酸性亚基和碱性亚基组成的复合物容易被解离。随着处理时间的延长，单独酸性偏移处理米糠蛋白的分子质量分布变化不明显，但结合热处理的米糠蛋白聚集体含量会略微增加。当处理时间5 h时，pH 1.5偏移结合50、60 ℃处理的米糠蛋白在保留时间5.97 min的峰面积百分比分别为2.74%、3.56%。由于米糠蛋白极易受内源脂质氧化酸败产物氧化，而热处理会加速蛋白质氧化，这可能是导致聚集体增加的主要原因[10,20]。

图1 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白分子质量分布的影响

2.4pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白亚基结构的影响

pH1.5偏移以及结合热处理米糠蛋白的亚基结构变化如图2所示，未处理的米糠蛋白亚基主要分布在40～60 ku, 37～39 ku和低于25 ku，其中37-39 ku是谷蛋白酸性亚基对应的条带[22]。当对米糠蛋白单独采用pH酸性偏移处理时，随着处理时间延长，明显看到37-38 ku条带的颜色变深，这印证了前面分子质量分布结果推测的蛋白质聚集体中酸性亚基和碱性亚基复合物发生解离的现象。当pH酸性偏移结合热处理时，亚基结构对应的条带又逐渐变浅，尤其是结合60 ℃热处理时，谷蛋白酸性亚基和低分子质量亚基逐渐消失。耿蕊等[23]在大豆分离蛋白的凝胶电泳图中也观察到，当pH 1.5偏移结合60 ℃ 热处理时，大豆蛋白亚基结构(尤其是酸性亚基和碱性亚基)显著减少。

2.5 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白内源荧光光谱的影响

pH 1.5偏移结合热处理的米糠蛋白内源荧光光谱如图3所示，随着处理时间延长，米糠蛋白最大荧光峰位均出现先红移再蓝移的变化趋势。未处理的米糠蛋白最大荧光峰位为346.0 nm，单独pH 1.5、pH 1.5偏移结合50 ℃和60 ℃处理的米糠蛋白最大荧光峰位均在处理时间3 h时达到最大值，分别为349.0 nm，347.2 nm和347.4 nm。内源荧光光谱中最大荧光峰位红移表明蛋白质中色氨酸残基微环境极性增强[10]。结合傅里叶变换红外光谱结果分析，pH 酸性偏移处理会诱导原先包裹在蛋白质内部的疏水侧链暴露到分子表面的极性环境中，使色氨基残基微环境发生改变。随着酸性偏移处理时间的延长，米糠蛋白最大荧光峰位发生蓝移，推断可能是暴露出来的疏水基团又因为疏水相互作用而聚集，使米糠蛋白中色氨酸残基微环境非极性增强。结果还显示，热处理会抑制米糠蛋白最大荧光峰位红移，结合分子质量分布和巯基变化结果推测，可能是热处理诱导米糠蛋白氧化聚集造成的。

图3 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白内源荧光光谱的影响

2.6 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白表面疏水性的影响

疏水相互作用是维持蛋白质三级结构的主要作用力，pH偏移处理大豆蛋白的研究已证实，极端pH条件下蛋白质分子结构容易展开，致使表面疏水性显著增加[6]。不同于大豆蛋白表面疏水性的持续增加，pH酸性偏移结合热处理米糠蛋白的表面疏水性变化极其复杂(图4)。这可能是由于相比大豆分离蛋白，米糠蛋白中残留的内源脂质氧化酸败产物更容易与其疏水侧链反应，导致表面疏水性下降[10]。因而，单独采用pH酸性偏移处理的米糠蛋白表面疏水性呈现上升-下降-再上升的复杂变化。从图4还可以看出，结合热处理的米糠蛋白表面疏水性明显大于单独采用pH偏移处理的。Bax关于肌原纤维蛋白的研究也发现，热处理会显著增加蛋白质的表面疏水性，并且热处理导致的表面疏水性增加有利于蛋白质无定形或纤维状聚集体的形成[24]。

注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，余同。图4 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白表面疏水性的影响

2.7 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白溶解性的影响

pH 1.5偏移结合热处理的米糠蛋白溶解性如图5所示，相比于未处理的米糠蛋白，单独采用pH 1.5偏移处理的米糠蛋白溶解性显著增加，这可能与酸性条件下米糠蛋白中天然聚集体的部分解离以及蛋白质分子的适度展开相关。随着处理时间延长，仅仅采用酸性偏移处理的米糠蛋白溶解性未发生显著变化，但酸性偏移结合热处理的米糠蛋白溶解性逐渐下降，结合前面的实验结果分析，这可能是加热条件下蛋白质分子通过疏水相互作用或氧化交联形成聚集体所致。

图5 pH酸性偏移结合热处理对米糠蛋白溶解性的影响

3 结论

米糠蛋白经pH酸性偏移结合热处理后，其结构特征发生了显著变化。pH 1.5偏移处理对米糠蛋白中较为稳定的α-螺旋和β-折叠结构影响较小，但会使部分无规卷曲和β-转角结构展开，形成氨基酸侧链，并伴随巯基氧化；结合热处理后，米糠蛋白二级结构呈现去折叠-复折叠的复杂变化，并且米糠蛋白巯基氧化程度增加。分子质量分布、蛋白质凝胶电泳和内源荧光光谱的结果分析表明，单独pH酸性偏移处理会促使米糠蛋白分子展开，导致酸-碱亚基复合物发生解离，但结合热处理后，米糠蛋白又会通过疏水相互作用或氧化作用等形成聚集体。表面疏水性和溶解性的变化进一步展现了米糠蛋白在pH酸性偏移结合热处理过程中空间结构的复杂变化，并印证了这一过程中米糠蛋白的展开-聚集行为。由此可见，通过更加深入地研究，pH酸性偏移结合热处理有望成为一种很好地调控米糠蛋白结构变化的方法。