冻融预处理提高糯米淀粉纳米小体的制备效率

汤振兴 陶湘林 魏颖娟 阳永建谢 军 向台双 唐汉军，

(湖南大学研究生院隆平分院1，长沙 410000)(湖南省农产品加工研究所2，长沙 410125)(怀化职业技术学院3，怀化 418000)

粮食作物的贮藏淀粉是半结晶的颗粒状高分子化合物。数十年来的研究表明，天然淀粉颗粒包含四次元结构[1-5]，即分子结构、结晶结构、纳米小体(blocklets)、颗粒组织结构。纳米小体是构筑天然淀粉颗粒组织的基本单元[5-8]。由于天然高分子纳米材料具有可再生和易降解的特性，在许多领域均具有极好的应用前景[9]，淀粉纳米小体及其纳米材料的制备技术受到越来越多的关注。常规方法是酸水解法和酶水解法[10-13]，但存在处理时间长(5 d以上)和目标产物得率低(小于10%)等问题。

Sun等[14]采用1%次氯酸钠氧化糯玉米淀粉后再进行轻度超声波处理，纳米小体的总得率可达70%，但其结晶结构完全被破坏。Kim等[15]将糯玉米淀粉在4 ℃硫酸水解6 d后的产物再进行轻度超声波处理，获得高得率的结晶纳米小体，但酸水解2 d和4 d获得的纳米小体其结晶结构完全被破坏。Haaj等[16]在低温下利用高功率超声波处理1.5%普通玉米和糯玉米淀粉乳液，75 min后粒径降解为 30～140 nm和30～250 nm的非结晶纳米小体。Amini等[17]将15%的普通玉米淀粉，在40 ℃的3.16 mol/L硫酸溶液中超声波处理45 min，最终获得21.6%有结晶的纳米小体。Kim等[18]和Park等[19]通过0.15N稀硫酸溶液处理糯玉米和普通玉米淀粉1 h，再在淀粉20%含水量条件下130 ℃热处理8 h，然后配制成1%的乳液在23 000 r/min下搅拌1 h，最终得到80%的非结晶纳米小体。已有方法的主要问题是，纳米小体结晶结构破坏较轻的制备方法，一般得率较低；而得率较高、时间较短的制备方法，一般严重破坏纳米小体的结晶结构。开发低水解、低损伤或无损伤、高产出的制备方法还需要做大量工作，同时为完全解析清楚纳米小体与支链等分子的关系，及其在天然淀粉颗粒组织中的排列方式，也迫切需要纳米小体的无损伤提取方法。

为了减少直链淀粉等成分的干扰，方便研究淀粉酸水解机理以及纳米小体结构与支链淀粉分子之间的关系，本研究选择糯米淀粉作为实验材料，探索了冻结后再解冻(冻融)预处理对低温酸水解的纳米小体的产出率及其形态、粒度和结晶结构等的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

糯米(糯2优561，产地湖南汨罗，2017年)；浓硫酸、HCl、苯酚、NaOH、正戊醇、NaN3等试剂均为分析纯。

1.2 仪器

PF-20R高速冷冻离心机，Sup-756紫外分光光度计，JB-10磁力搅拌器，sigma-300扫描电镜，SCIENTZ-950E超声波细胞破碎仪，101-1AB型电热鼓风干燥箱，NanoBrook 90Plus Zeta动态光散射纳米粒度分析仪，D8 Advance粉末X射线衍射仪。

1.3 方法

1.3.1 淀粉提取

采用碱-醇法提取[20]。称取糯米100 g于烧杯中，加入400 mL水在4 ℃下浸泡24 h后，用打浆机打成均匀米浆，过120目筛，离心收集粗淀粉(10 000×g，5 min)。湿米粉加入0.1%NaOH溶液400 mL，搅匀成悬浮液，在4 ℃下300 r/min搅拌2 h以上，离心收集湿淀粉(10 000×g；5 min)，该碱洗处理重复1次。然后湿淀粉用400 mL水均匀悬浮，用0.1 mol/LHCl调节pH至7左右。加入正戊醇100 mL，在4 ℃下300 r/min搅拌5 h以上，4 ℃下静置12 h以上，小心吸去醇液层，再加入正戊醇100 mL，在4 ℃下300 r/min搅拌5h后静置，该醇洗处理直至醇液层透明为止。过400目筛后，离心收集湿淀粉(10 000×g；5 min)，加95%乙醇500 mL搅拌30 min后，用G4砂芯漏斗抽滤，95%乙醇100 mL洗3次，100 mL无水乙醇洗1次，100 mL乙醚洗2次。最后40 ℃烘箱中除去吸附的乙醚，放干燥器中备用。

1.3.2 冻融预处理

加5倍离子水的淀粉在室温下浸泡2 h，离心收集湿淀粉(3 000×g，5 min)，放入-5 ℃下缓慢冷冻2 h后以上，40 ℃水浴中解冻30 min，重复该冷冻-解冻处理1～3次。用G4砂芯漏斗抽滤，5倍95%乙醇洗3次，适量无水乙醇洗1次，乙醚洗2次。最后40 ℃烘箱中除去吸附的乙醚，作为冻融处理淀粉样品。

1.3.3 低温硫酸水解

参考Kim等[15]的方法。称取2.5 g淀粉样品(W)，用3.16 mol/L硫酸溶液调制成15%的淀粉悬浮液，在4 ℃条件下，以120 r/min的速度搅拌水解1～6 d，每天的样品做2个平行。

1.3.4 水解产物的收集处理

将每天的样品取出，分别加水稀释10倍后离心(4 ℃，3 000×g，10 min)，沉淀用适量的水搅匀，再离心，直至上清液达到中性，加入沉淀5倍体积的95%乙醇，按照上述淀粉收集和干燥的方法处理，作为水解淀粉残渣。离心的所有上清液收集一起定容，作为上清1，其总糖采用苯酚-硫酸法测定，根据定容体积计算出总糖质量(m1)。

取100 mL上清液1加入95%乙醇400 mL，静置2 h后离心(4 ℃，10 000×g，5 min)，沉淀加入适量水分散后加入5倍95%乙醇，搅拌5 min，离心(4 ℃，10 000×g，5 min)，反复操作至上清液为中性，然后再依次用适量95%乙醇洗3次，无水乙醇洗1次，乙醚洗1次，40 ℃烘箱中除去多余的乙醚，作为纳米小体样品。离心的所有上清液收集一起定容，作为上清液2，上清液2的总糖采用苯酚-硫酸法测定，根据定容体积计算出总糖质量(m2)。

纳米小体得率=(m1-m2)/m×100%

1.3.5 SEM观察

淀粉和水解残渣的观察样品，均匀吹附于样品台的导电胶上，在10 mA的电流下喷金120 s，进行观察。

纳米小体观察样品制作，将25mg纳米小体样品配制成0.1%的悬浮液，在冰浴中超声波处理10 min(100 W，20 kHz，输出功率50%)，吸取200 μL滴到干净的盖玻片上，在室温或40 ℃烘箱中风干后，再滴加200 μL风干(重复3～4次操作)。小心取部分盖玻片贴到样品台的导电胶上，在10 mA的电流下喷金120 s，进行观察。

1.3.6 粒度分布分析

将20 mg纳米小体样品配制成0.2%的悬浮液，在冰浴中超声波处理(100 W，20 kHz，输出功率50%)至透明状态，倒入石英比色皿内，观察无气泡和沉淀，放入纳米粒度分析仪进行测定。

1.3.7 结晶分析

平衡样品含水量至恒定10%，采用粉末X 射线衍射分析仪测定。测试条为：Cu K辐射，管压40 kV，管流30 mA，扫描速度5(°)/min，扫描范围2 U：5°～40°，通过MDI Jade 6.0软件计算结晶度。

1.3.8 纳米小体稳定性实验

称取纳米小体样品20 mg于透明玻璃瓶中，加入20 mL蒸馏水作为分散剂(含0.02% NaN3)，配制成0.1% (m/V)的纳米小体悬浮液，在冰浴中超声波处理(300 W,20 kHz,输出功率50%)至透明状态后，在室温下静置观察，每隔一段时间拍照纪录状态。

1.3.9 数据处理与统计分析

所有实验数据均采用Excel2010和SPSS7.0进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 纳米小体得率和酸水解率

在4 ℃下硫酸水解至6 d的纳米小体得率如图1所示。原淀粉和冻融预处理淀粉均随水解时间延长呈直线上升的趋势。冻融预处理3次、1次与无预处理淀粉之间有显著差异，水解6 d后，纳米小体得率分别达到20.9%、9.8%、6.7%，冻融预处理3次的得率是其他处理的约2～3倍，也远高于LeCorre等[13]报道的40 ℃酸水解和酶水解糯玉米淀粉时纳米小体的得率。

另外，冻融预处理3次、1次与无预处理淀粉6 d后的加水分解率分别为1.4%、1.5%和1.8%(图2)，整体上均显示了较低的水解度，数值远低于40 ℃酸水解[15]和酶水解[12]，也比同为4 ℃下酸水解糯玉米淀粉的加水分解率低[15]。预处理3次与1次之间没有显著差异，但与无预处理之间有显著差异。

这些结果表明，冻融预处理改变了淀粉的原有组织结构，可提高酸水解时纳米小体从淀粉颗粒组织中游离出来的速度，且预处理次数越多效果越显著，同时有可能减少了纳米小体游离时的损伤程度，在低温环境下，一定程度避免了纳米小体游离出来后被水解。

注：NFT：未冻融处理；FT1：冻融处理1次；FT3：冻融处理3次。图1 酸水解淀粉的纳米小体得率变化

图2 淀粉酸水解6 d的加水分解率

2.2 淀粉的SEM观察

原淀粉和酸水解后的淀粉残渣的形态如图3所示。原淀粉酸水解6 d后还能观察到没有水解痕迹的淀粉颗粒，但冻融预处理淀粉残渣中几乎看不到完整的淀粉颗粒，冻融预处理3次的淀粉残渣比预处理1次的碎片化程度更高。进一步说明冻融预处理对原淀粉颗粒组织的松散效果明显，有利于纳米小体的游离，与得率趋势结果相符。

通过SEM观察，3个处理的纳米小体均为10～100 nm粒径的球状颗粒，不同处理之间整体上颗粒的形态和大小没有明显的差异，与之前的报告类似[7,15]。但观察样品制作技术不成熟，集结在一起的现象比较多，需要改进。

注：NFT：未冻融处理的纳米小体聚集体；FT1：冻融处理1次的纳米小体聚集体；FT3：冻融处理3次的纳米小体聚集体。图4 酸水解6 d的纳米小体聚集体SEM观察

2.3 纳米小体的粒度分布

图5表示了酸水解6 d后获得的纳米小体粒度分布图谱。从基于体积的分布图，3个处理样品均可看到没有完全分散的集结颗粒显示的小峰，也有可能是混入的淀粉颗粒碎片的峰，NFT位于870～1 300 nm，FT1在65～90 nm和365～505 nm两处，FT3位于1 050～1 600 nm。但从基于数量的分布图看，这些颗粒的频率百分比几乎为零。NFT纳米小体粒径的峰值为19.5 nm，分布范围17～23 nm。FT1纳米小体粒径的峰值为21.0 nm，分布范围20～26 nm。FT3纳米小体粒径的峰值为26.9 nm，分布范围23～35 nm。说明酸水解的作用位置主要是非结晶领域[11,12]，即支链分子的簇状结构不能参与结晶的分支点领域和簇状结构之间链接作用的长链(≥B2)[1,11]。从FT3纳米小体产物的尺寸来看，单个纳米小体至少由2～4个簇状结构组成[5]，比FT1和NFT的纳米小体更好地保持了原淀粉颗粒组织中纳米小体的结构。这些结果表明冻融预处理可减少酸对纳米小体结构的伤害。

注：NFT：未冻融处理的纳米小体；FT1：冻融处理1次的纳米小体；FT3：冻融处理3次的纳米小体。图5 酸水解6 d的纳米小体粒度分布

2.4 粉末X射线衍射分析

从原淀粉的粉末X射线衍射图谱可知(图6)，糯米淀粉是典型的A型结晶结构[11,12]，相对结晶度为42.01%。从FT3酸水解6 d后纳米小体的主要峰型判断，依然维持了A型结晶结构，但相对于原淀粉的峰强度有所减小，相对结晶度有所增加，达到45.03%，这是由于非结晶领域被水解的缘故。结合SEM和粒度分布测量结果分析，采用乙醇沉降收集的纳米小体样品，可能包含可被乙醇沉降的水解产物糊精组分。为获得更准确的结果，纳米小体的收集方法有待进一步改良。

注：FT3：冻融处理3次酸水解6 d的纳米小体聚集体。图6 淀粉的X射线衍射图谱

2.5 淀粉乳液的稳定性

为进一步观察纳米小体的纳米材料特性，将原淀粉和酸水解6 d的纳米小体聚集体样品配制成0.1%水乳液(含0.02%NaN3)，比较了在室温下的稳定性。刚配制的纳米小体乳液均为透明液体，纳米粒子(1～100 nm)乳液的丁达尔效应很明显[22]。第3天时，原淀粉完全沉淀，而纳米小体样品则由透明状液体变成浑浊状态，但这种状态90 d后依然维持不变，且同样呈现了丁达尔效应，展现了纳米材料的高稳定性。从白光柱亮度和清晰度的状态，FT3纳米乳液比NFT的更好，比文献报道稳定性实验时间更长[22,23]，充分展现了作为纳米材料优良特性之一的乳液高稳定性。3 d后出现的浑浊现象，可能是由于纳米小体不够纯净，混杂的糊精慢慢凝聚的缘故，但由于整体浓度较低，水分子的分散力与颗粒间的凝聚力之间趋于平衡状态，所以维持了较长的乳液稳定。

3 讨论

本研究的糯米淀粉为实验材料，探索了冻融预处理对低温酸水解的纳米小体的产出率及其形态、粒度和结晶结构等的影响。在4 ℃下硫酸水解至6 d后，整体上均显示了非常低的加水分解度(1.4%～1.8%)，数值远低于40 ℃酸水解[15]和酶水解[12]，也比同为4 ℃下酸水解糯玉米淀粉的加水分解率低[15]。但获得了远高于40 ℃酸水解和酶水解糯玉米淀粉时纳米小体的得率[13]。冻融预处理3次的纳米小体得率最高，达到20.9%，比冻融预处理1次和无预处理高2～3倍。通过对各处理的酸水解淀粉残渣观察，无预处理原淀粉酸水解6 d后还能观察到没有水解痕迹的淀粉颗粒，但冻融预处理淀粉残渣中几乎看不到完整的淀粉颗粒，冻融预处理3次的比预处理1次的碎片化程度更高。说明冻融预处理对原淀粉颗粒组织的松散作用明显，处理次数多效果更好，产出率较高。

酸水解6 d后获得的纳米小体均为球状颗粒，与前人研究类似[7,15]。粒度分布分析显示，无预处理的纳米小体粒径峰值为19.5 nm，分布范围17～23 nm；冻融预处理1次的纳米小体粒径峰值为21.0 nm，分布范围20～26 nm；冻融预处理3次的纳米小体粒径峰值为26.9 nm，分布范围23～35 nm。从纳米小体产物的尺寸来看，单个纳米小体至少包含2～4个簇状结构[1,5]，冻融预处理3次的比预处理1次和无预处理的纳米小体更好地保持了原淀粉颗粒组织中纳米小体的结构。虽然酸水解6 d后的粉末X射线衍射分析依然维持了糯米淀粉的A型结晶图谱[11,12]，但对比原淀粉的峰强度减小和相对结晶度的增加，冻融预处理3次的纳米小体结构一定程度被水解损伤。不过充分展现了作为纳米材料优良特性之一的乳液高稳定性[22,23]，0.1%的纳米小体水乳液(含0.02%NaN3)90 d后依然稳定。但采用乙醇沉降收集纳米小体样品，也许样品中包含有被乙醇沉降的水解产物糊精组分，在今后的研究中特别是普通淀粉材料，不能忽视直链淀粉和糊精组分的干扰，纳米小体产物的收集方法有待进一步改良。

这些结果分析说明，酸水解最先的作用位置主要是淀粉非结晶领域[11,12]，即支链分子的簇状结构不能参与结晶的分支点领域和簇状结构之间链接作用的长链(≥B2)[1,11]。冻融预处理可有效改变淀粉的原有组织结构，使纳米小体从淀粉颗粒组织中游离出来变得更容易，从而损伤程度更小，游离出来后抵抗酸水解的能力更强。但即便是在低温环境下被长时间酸处理，也会对结晶领域产生一定的伤害。因此，如果冻融预处理更充分些，并及时将纳米小体从反应系统中分离出来，可能会获得更好的结果。

4 结论

冻融预处理可有效松散淀粉颗粒组织结构，促进酸水解时纳米小体的游离速度，显著提高单位时间内的纳米小体产出率；完善预处理方法，应是一条保留原结晶特性的纳米小体的制备技术途径；对于为分析天然淀粉纳米小体与支链淀粉等分子之间的关系，以及完全破解天然淀粉颗粒结构的研究时实验样品的准备有一定参考意义。