酱油渣中免疫活性肽水解用酶的筛选

于志成 刘步青 许 宙 陈茂龙 焦 叶崔 波 邹飞雪 藏庆佳 程云辉,

(长沙理工大学化学与食品工程学院1,长沙 410114)(齐鲁工业大学(山东省科学院)食品科学与工程学院；生物基材料与绿色造纸国家重点实验室2, 济南 250353)(烟台双塔食品股份有限公司3,烟台 265404)

酱油发酵后经压榨或抽油产生的剩余残渣即为酱油渣[1]。据中国调味品协会统计，2017 年我国酱油生产总量已达860万 t[2]，按照每生产1 t酱油产生0.67 t酱油渣计算[3]，酱油渣年产量可达580万 t。酱油渣中含有粗蛋白、碳水化合物和粗脂肪等营养成分[4,5]，不失为一种廉价的生物资源，特别是其中的大豆分离蛋白营养价值高、氨基酸含量丰富，被誉为“植物肉”[6]。目前酱油渣再利用的主要途径是生产饲料[7]，但存在含盐量较高、适口性较差及不易贮存等缺点[8]，在一定程度上限制了酱油渣的应用价值。利用合适的水解酶从酱油渣蛋白中制备免疫活性肽，可使酱油渣资源得到更高值化利用[9]。

免疫活性肽是指对机体免疫系统具有调节作用的一类生物活性肽，其免疫调节作用包括免疫促进和免疫抑制[10,11]。免疫活性肽虽本身不具有免疫原性，但能通过被肠道吸收或在肠道与受体结合而发挥免疫作用[12]。近年来，人们对食源性蛋白中免疫活性肽的研究日益增多，食物蛋白来源包括牛奶、鱼类、贝类、大米、大豆等[13]。国内外制备活性肽的方法主要有酶解法[14]、化学合成法[15]、基因重组法[16]及微生物发酵[17]等，其中使用商业蛋白酶进行体外水解是最常用的方法，肽键的裂解能够释放具有免疫调节活性的肽段。由于酶的不同切割特异性，选择合适的蛋白水解酶成为关键技术因素。评价蛋白水解产物免疫调节作用的常用研究方法包括细胞实验和动物喂养实验[13]。由于巨噬细胞是体液免疫的重要防线，所以巨噬细胞增殖能力的强弱与体液免疫能力有着重要关系[18]，采用MTT法检测巨噬细胞活性已被较广泛运用于评价生物活性肽的免疫调节作用。同时，由一氧化氮合酶催化L-精氨酸产生的NO，能作为一种重要的细胞分泌物在炎症和休克等生理过程中担任信号分子的作用，通常可用NO的释放量来衡量巨噬细胞中的炎症作用[19]。

因此，本研究以小鼠巨噬细胞增殖实验的SI值和脂多糖炎症模型细胞内NO释放量作为免疫活性肽的筛选指标，拟利用Acalase、Papain、Pepsin、Trypsin与Protamex 5种蛋白酶对酱油渣蛋白进行酶解，进而对5种酶解物的免疫活性、多肽含量、可溶性氮回收率和相对分子质量进行分析，筛选出最佳的酱油渣免疫活性肽水解用酶，为酱油渣资源高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱油渣、小鼠巨噬细胞(RAW264.7)、石油醚、Folin酚、L-酪氨酸；Acalase、Papain、Pepsin、Trypsin及Protamex；D201-C大孔吸附树脂。

1.2 仪器与设备

FE28 pH计，JJ-T电动搅拌器，TDL-5-A离心机，SHZ-D循环水式真空泵，EV 311旋转蒸发器，FD-1真空冷冻干燥机，HH CP-01二氧化碳细胞培养箱，MLS-3750灭菌锅，SW-OJ-1FD超净工作台， 96孔培养板；血球计数板，DNM-9602酶标分析仪。

1.3 方法

1.3.1 酱油渣蛋白粉的制备方法[20]

1 kg脱脂酱渣粉溶于10 L蒸馏水中，用2 mol/L氢氧化钠调溶液pH至10→搅拌2 h→离心(3 500r/min,30 min)→取上清→用2 mol/L盐酸滴定至pH 4.0→离心(3 500 r/min,10 min)→水洗3次(3 500 r/min,10 min)→取沉淀→冷冻干燥。

1.3.2 酱油渣蛋白酶解物制备方法[20]

5种蛋白酶的酶解条件见表1。5%酱渣蛋白悬浮液→50 ℃恒温溶解30 min→调至各酶最适温度→调至各酶最适pH→加酶酶解3 h(6 000 U/g)→灭酶(15 min，90 ℃)→离心取上清→真空浓缩→大孔吸附树脂脱盐→冷冻干燥。

表1 5种蛋白酶的酶解条件

1.4 分析方法

1.4.1 基本成分分析方法

水分含量的测定参考GB/T 5009.3—2016中的直接干燥法；蛋白含量的测定参考GB/T 5009.5—2010中的凯氏定氮法；脂肪含量的测定参考GB/T 5009.6—2016中的索氏提取法；总糖含量的测定用苯酚硫酸法[21]；盐分的测定参考GB 5009.44—2016中的电位滴定法。

1.4.2 蛋白酶活力的测定方法

参考GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》。

1.4.3 多肽含量的测定方法

参考GB/T 22492—2008《大豆肽粉》[22]。

1.4.4 相对分子量测定方法

相对分子量采用液相色谱[23]法测定：

1)色谱条件：色谱柱为TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm。流动相使用水/乙腈/三氟乙酸，90/10/0.1；经0.45 μm滤膜过滤后再经超声进行脱气。洗脱流速0.5 mL/min，检测波长220 nm，柱温30 ℃，上样量10 μL。

2)样品的制备：用流动相将样品配成浓度为1 mg/mL的样液，超声混匀，用微孔滤膜过滤后待测。

3)分子量校正曲线所用标准品：甘氨酸-酪氨酸(MW239.2)；缬氨酸-酪氨酸-缬氨酸(MW379.5)；蛋氨酸脑啡肽(MW573.23)；亮氨酸脑啡肽(MW555.63-569.65)；血管紧张素Ⅱ(MW1 269)；细胞色素C(MW12 900)。

1.4.5 小鼠巨噬细胞增殖实验方法

MTT法测定小鼠巨噬细胞的增殖活性。用移液枪取对数期的小鼠巨噬细胞，细胞浓度7×105个/mL、每孔100 μL接种于96孔板中，在5% CO2的培养箱中37 ℃恒温孵育4 h后，以6复孔为一组，每孔加入酱油渣蛋白酶解物20 μL(6.25 μg/mL)，空白对照组加无菌水20 μL，继续在培养箱中恒温孵育20 h；在终止孵育前4 h加入20 μL MTT(5 mg/L)；弃去每孔中的液体，向每孔中加入150 μL二甲基亚砜，避光条件下摇床中轻振10 min[24]，490 nm下酶标仪测吸光度(OD值)，SI值计算公式：

1.4.6 酶解物对脂多糖炎症模型细胞内NO释放的影响

当培养皿中的小鼠巨噬细胞生长至对数期时，弃掉细胞培养基上清，用移液枪吸取2 mL培养基将细胞轻轻吹下，12 000转离心收集细胞，96孔培养板中接种3×104个/孔的细胞，每孔200 μL细胞液，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，以6复孔为一组，分为阴性对照组、LPS炎症模型组、阳性对照组和酱油渣蛋白酶解物预处理组[25]：

1) 阴性对照组：加入含10% FBS的DMEM培养基；

2) 炎症模型组：加入含10% FBS的DMEM培养基，培养12 h，再加入用DMEM培养基稀释的LPS溶液20 μL，培养24 h；

3) 阳性对照组：加入含10% FBS的DMEM培养基，培养12 h，再加入用无菌水稀释的IgG 20 μL，培养24 h；

4) 样品预处理组：加入无菌水溶解的样品溶液，使样品的终浓度为6.25 μg/mL，培养12 h，加入用DΜEM培养基稀释的LPS溶液，培养24 h。

收集细胞培养基上清，于4 ℃、12 000 转低温离心5 min以去除细胞杂质等。根据GRIESS法测定上清液中NO含量。NO抑制率公式：

NO抑制率=

1.5 可溶性氮回收率的测定方法

采用福林酚法测定上清液蛋白质含量[26]：使用0.05 mol/L (pH8.0) NaHPO4-NaH2PO4缓冲液将上清液稀释一定倍数至测定范围，取2.5 mL稀释样品于10 mL玻璃试管，加入2.5 mL碱性铜试剂，振荡混匀，室温放置10 min，再加入0.25 mLFolin-酚试剂，立即振荡混匀，室温放置30 min后于500 nm下测定吸光度。配制0～0.5 mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)标准曲线，计算上清液蛋白质含量。

上清液蛋白质量(g)=上清液蛋白含量×上清液体积

酱油渣蛋白质量(g)=酱油渣蛋白含量×酱油渣质量

酱油渣蛋白可溶性氮回收率=

1.6 数据处理

实验均设置3次平行，结果用平均值±标准偏差表示。实验数据采用excel进行分析，每组间差异用Student’s t-test平均值的成对二样本进行分析，P<0.01表示有极显著性差异，P<0.05表示有显著性差异，P>0.05表示没有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 酱油渣和酱油渣蛋白基本成分分析

对酱油渣原料干基及所提取的酱油渣蛋白的主要成分进行测定，结果见表2。脱脂后提取的酱油渣蛋白脂肪质量分数降为1.23%；盐分和水分质量分数分别降为0.91%和2.42%；而总糖质量分数从10.31%提高至37.52%，张兴茂[20]通过Sevag试剂法来验证糖蛋白，推测酱油渣蛋白中含有大量的糖蛋白，据此可认为酱油渣蛋白中总糖含量的提高与提取过程中糖蛋白的富集有关。

表2 原料酱油渣(干基)及酱油渣蛋白的主要化学成分

2.2 不同蛋白酶酶解物可溶性氮回收率的比较

2.2.1 蛋白酶选择及酶活测定

目前蛋白酶主要来源于动物、植物和微生物，Pepsin和Trypsin是动物来源的蛋白酶，Pepsin的酶切位点是Phe和Leu等疏水性氨基酸，Trypsin的酶切位点为赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等碱性氨基酸[27]；Papain是一种植物来源的蛋白酶，其酶切位点是Arg、Lys、Phe，其中Arg和Lys是碱性氨基酸，而Phe是疏水性氨基酸[27]；Protamex和Acalase是微生物来源的蛋白酶，复合蛋白酶兼具内、外切酶的活性，能较彻底地酶解蛋白质，Acalase的酶切位点是Ala、Leu、Val等疏水性氨基酸，酶切位点广泛，水解效果好[28]。本研究拟在同等酶活下考察5种酶的酶解产物在免疫活性、分子量分布及可溶性氮回收率方面的差异，因此参照GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》测定了所选定5种蛋白酶的酶活，结果如表4所示。由表3可知，Acalase酶活最高，可达276 229.6 U/g。

表3 实验所用5种蛋白酶的酶活

2.2.2 不同蛋白酶酶解物可溶性氮回收率的分析

注：*与对照组相比，P<0.05；**与对照组相比，P<0.01。图1 5种蛋白酶酶解物可溶性氮回收率的比较

本研究比较了5 种酱油渣蛋白酶酶解物的可溶性氮回收率，结果如图1所示。5种蛋白酶酶解物中Protamex酶解物可溶性氮回收率最低，与Protamex酶解物(对照组)可溶性氮回收率相比，Papain酶解物差异不显著，Pepsin酶解物差异显著(P<0.05)，Acalase和Trypsin酶解物差异极显著(P<0.01)，且Acalase酶解物可溶性氮回收率最高为89.43%。在工业化生产中，提高酶解物的可溶性氮回收率，具有降低生产成本、提高原料利用效率等优点。

2.3 酱油渣蛋白不同蛋白酶酶解物的多肽含量分析

对酱油渣蛋白不同蛋白酶酶解物的多肽含量进行测定，结果见表4。5种蛋白酶酶解物中多肽含量最高的是碱性蛋白酶酶解物，占比51.47%；而在可溶性氮回收率的测定结果中碱性蛋白酶酶解物的可溶性氮回收率也最高，二者结果一致。

表4 5种蛋白酶酶解物的多肽含量

2.4 不同蛋白酶酶解物的性质研究

2.4.1 不同蛋白酶酶解物免疫活性研究

分别以小鼠巨噬细胞RAW264.7 MTT增殖实验SI值和脂多糖(LPS)炎症模型细胞内NO释放量作为考察指标，考察了不同蛋白酶酶解物的免疫活性，结果如图2和图3所示。

注：*与对照相比，P<0.05；**与对照相比，P<0.01。图2 5种蛋白酶解物对RAW264.7细胞增殖活性的影响

由图2可知，除Acalase酶解物外，其他4种蛋白酶酶解物在浓度6.25 μg/mL时对小鼠巨噬细胞RAW264.7皆具有显著增殖作用(P<0.05)，但Trypsin和Protamex酶解物增殖作用高于阳性对照IgG，Pepsin和Papain酶解物增殖作用低于阳性对照IgG。Acalase酶解物在6.25 μg/mL时对RAW264.7细胞的增殖作用存在极显著差异(P<0.01)，其SI值最高为1.09且比阳性对照IgG的增殖效果好。

注：##：与阴性对照组比有极显著差异P<0.01；*：与炎症模型组比有显著差异P<0.05；**：与炎症模型组比有极显著差异P<0.01。图3 5种蛋白酶解物对LPS内诱导RAW264.7细胞内NO释放量的影响

由图3可知，在6.25 μg/mL的浓度下，不同酶解物对NO的抑制效果有显著差异，这可能跟其酶切位点及特异性不同相关。与炎症模型组相比，Pepsin酶解物、Trypsin酶解物和Protamex酶解物对细胞内NO释放量都存在一定抑制作用，但抑制率相对较低；Papain酶解物对细胞内NO释放量存在显著(P<0.05)抑制作用，抑制率为7.81%；Acalase酶解物对细胞内NO释放量存在极显著(P<0.01)抑制作用，抑制率为10.80%，Acalase酶解物对细胞内NO释放量的抑制作用最强。

MTT增殖实验和脂多糖(LPS)炎症模型实验表明碱性蛋白酶酶解物对RAW264.7细胞增殖效果及细胞内NO释放抑制作用皆为最强。这可能跟Acalase 的酶切位点有关，有研究表明，多肽的免疫活性可能与其所含疏水性氨基酸的比例相关[29]。Acalase的酶切位点为Ala、Leu、Val，采用该酶水解食源性蛋白可能获得更多富含疏水性氨基酸的酶解物。Lee等[30]采用碱性蛋白酶酶解短颈蛤蛋白，得到的肽序列Gln-Cys-Gln-Gln-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Val能在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中显示出NO抑制活性，其中含有疏水性氨基酸。He等[31]从波纹巴非蛤肉蛋白碱性蛋白酶解物中得到的免疫活性肽Pro-His-Thr-Cys，Val-Gly-Try-Thr，Glu-Phe，Leu-Phe等能够显著增强小鼠淋巴细胞增殖能力，其中疏水性氨基酸比例较高。

2.4.2 不同蛋白酶酶解物分子量分布的分析

采用液相色谱对不同蛋白酶酶解物的分子量分布进行测定，结果如表5所示。5种蛋白酶酶解物的分子量分布范围主要在2 000 u以下，免疫活性较好的Acalase和Papain酶解物中2 000 u以下的组分分别占98.21%、97.74%，其中分子量在180 u以下的比例分别为5.92%和6.13%，因此可推断酶解物中游离氨基酸的含量较低；分子量分布在3 000 u以上的比例分别仅为0.11%和0.12%，说明酶解物中的大分子量肽段很少。肽的免疫活性与其分子量大小密切相关，大量研究结果表明小分子量肽段的免疫活性较好[13]。据此可推测5种蛋白酶酶解物中分子量范围为180～1 000 u的肽段可能具有较强的免疫活性。Acalase酶解物和Papain酶解物中180～1 000 u的肽段比例较高，分别为81.33%和78.03%，这可能也是两种酶解物具有较强免疫活性的原因之一。

表5 5种蛋白酶酶解物的分子量分布

3 结论

通过考察5种酱油渣蛋白酶酶解物对小鼠巨噬细胞增殖指数SI值、脂多糖(LPS)炎症模型中细胞内NO释放量的抑制作用、相对分子量分布、多肽含量及可溶性氮回收率，本研究认为Acalase是制备酱油渣免疫活性肽的最佳水解酶，其SI值、NO释放量抑制率、分子量180～1 000 u的组分占比、多肽含量及可溶性氮回收率分别为1.09、10.80%、81.33%、51.47% 和89.43%。其酶解物不仅免疫活性较好，而且多肽含量和可溶性氮回收率较高，工业推广方面应用前景广阔。