高粱酒糟高纯度黄酮的制备及其抗氧化活性

蒋新龙 王 浩 蒋益花

(浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015)

高粱 (Sorghumbicolor(L.)Moench) 属禾本科高粱属一年生草本植物，用途广泛，经济价值高，既可食用、饲用，又可用于加工[1]。高粱中除含有丰富的单宁多酚成分外，还含有具有较好抗氧化活性的类黄酮、酚酸、原花青素等多种酚类化合物[2-4]。袁蕊等[5]用溶剂提取法提取高粱黄酮含量为0.54%；安静等[6]分别采用溶剂提取法、超声提取法和微波提取法等提取方法，测得高粱黄酮质量分数为2.38～2.77 mg/g；田新惠等[7]以6种酿酒高粱籽粒为研究对象，研究发现其总黄酮为123.06～434.84 mg/100 g，而且有良好的抗氧化活性。高粱是生产白酒的主要原料，高粱酒糟是酿酒工业的副产物，大多被用于加工饲料、肥料等方面，目前对于高粱酒糟深层次的开发应用很少。针对高粱酒糟资源化综合利用及天然抗氧化剂市场的需求问题，以高粱酒糟为原料，用微波协同双水相提取黄酮；以所得黄酮粗提物为处理对象，采用多级双水相体系纯化得到高纯度黄酮；以所得高纯度黄酮为处理对象，对其抗氧化活性进行研究，为高粱酒糟综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高粱酒糟取自当地酒厂，采用几何采样法进行样品采集，将新鲜酒糟装入密封袋后用保鲜盒带回实验室，65 ℃烘箱烘干，粉碎过40目筛，备用。DPPH·、芦丁、所用水为蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

UV-1600型紫外可见光谱仪，格兰仕微波炉D8017TL-2H型，GZX-91400MBE电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 总黄酮的测定

根据硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定黄酮含量[8]。用80%乙醇准确配制0.2 mg/mL芦丁标准液。分别精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁标准液分别置于10 mL比色管中，各加80%乙醇至5 mL，加0.5 mL 5%NaNO2溶液，摇匀放置6 min，再加0.5 mL 10%A1(NO3)3溶液，摇匀，再放置6 min，加4 mL 4%NaOH溶液，摇匀放置15 min，同时做空白对照，在510 nm波长处测定吸光度，得芦丁质量浓度C(mg/mL)与吸光度A之间的关系式为：A=25.289C+0.037 2，相关系数r=0.997 3。

精密吸取待测液1.0 mL于10 mL比色管中，按前述方法进行操作，同时做空白对照，在510 nm波长处测定吸光度值。按回归方程计算样品液中黄酮得率Y。

式中：C为回归方程的计算所得值/mg/mL；V为提取液总体积/mL；m为所用原料的质量/g；n为稀释倍数。

1.2.2 黄酮提取实验设计

双水相体系的确定：徐方祥等[9]用微波辅助乙醇-磷酸氢二钾双水相法提取了菠萝皮中的黄酮。根据池汝安等[10]采用浊点法所绘制的各双水相体系相图和南二龙[11]所建立的相比数据库，本研究选取乙醇溶液作为有机相、磷酸氢二钾作为分相盐组成乙醇-磷酸氢二钾双水相提取高粱酒糟黄酮。

提取方法：精密称取一定质量的原料置于提取容器中，加入一定体积无水乙醇、一定质量的无机盐、一定体积水组成的双水相体系，在一定微波条件下提取一定时间，趁热抽滤得滤液。静置5 min，待其分层，收集上清液，得到黄酮提取液，测定黄酮得率。

单因素实验：按照1.2.2提取方法，在原料质量1.000 0 g、乙醇体积分数80%、磷酸氢二钾用量10 g、微波时间50 s、微波功率中火、液料比50∶1的条件下，采用控制变量法进行单因素实验。分别设置乙醇体积分数梯度40%、50%、60%、70%、80%；磷酸氢二钾用量梯度8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 g；液料比梯度30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1；提取时间梯度为20、30、40、50、60 s；微波功率梯度为低火144 W、中低火288 W、中火464 W、中高火648 W、高火800 W，考量乙醇体积分数、磷酸氢二钾用量、液料比、提取时间和微波功率五因素对黄酮得率的影响。

响应面优化实验：因为微波功率作为离散型变量不宜使用响应面方法，最佳微波功率作为响应面实验的固定条件。在单因素实验的基础上，固定一个双水相体系影响因子(磷酸氢二钾用量或乙醇浓度)，选取剩余3个因素为自变量，以黄酮得率为评价指标，利用响应面实验对提取条件进行优化。

1.2.3 黄酮纯化实验设计

利用多级双水相体系纯化：用最佳提取工艺进行双水相提取，得上相1；将上相1在40 ℃用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇，得到浓缩液1，冷冻干燥浓缩液1可得粗黄酮产品1；将浓缩液1加入一定量磷酸氢二钾和无水乙醇重新得到最佳提取条件时的双水相体系，以4 000 r/min离心20 min，得上相2，同样用旋转蒸发仪浓缩上相2得到浓缩液2，冷冻干燥浓缩液2可得纯化黄酮产品Ⅱ。分别测定2次双水相上、下相中黄酮含量，求出两次双水相体系的分配系数及两个黄酮产品的纯度。

1.2.4 黄酮抗氧化活性实验设计

将粗黄酮产品和纯化黄酮产品加无水乙醇配制成黄酮含量为100 μg/mL的高浓度溶液，再用无水乙醇稀释成梯度系列样品溶液(2、5、8、10、20、40、60、80 μg/mL)。以VC做参比，以半数清除率IC50值为抗氧化活性评价指标，比较高粱酒糟纯化黄酮、高粱酒糟粗黄酮、VC抗氧化活性相对大小。

1.3 统计方法及分析软件

实验均重复测定3次并取平均值，利用Origin8软件作图；响应面优化采用 Design-Expert 8.06 软件进行实验设计及回归分析；应用SPSS20.0软件进行数据统计；用Duncan多重比较(SSR法)检验各处理平均数之间的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 黄酮提取实验

2.1.1 单因素实验结果及分析

乙醇体积分数对黄酮得率的影响：由图1可知，乙醇体积分数80%时黄酮的得率达到最高值。因为乙醇体积分数80%与其他水平差异显著，所以响应面优化实验时以乙醇体积分数80%为固定值，通过优化调节磷酸氢二钾用量获得高选择性双水相体系。

磷酸氢二钾用量的影响：双水相的形成是乙醇与磷酸氢二钾争夺水分子的过程。在乙醇-磷酸氢二钾双水相中，上相则由混有少量水的乙醇构成，下相由溶解有磷酸氢二钾的水及少量乙醇构成。黄酮是醇溶性的，提取后进入上相。磷酸氢二钾的用量改变可影响到上相极性[14]，最终影响到黄酮的得率。图1可知，磷酸氢二钾用量为10.0 g/50 mL时，黄酮的得率达到最高值。

液料比对黄酮得率的影响：图1可知，液料比高于50∶1时，黄酮的得率达到最高值。30～50∶1范围内，黄酮得率随着液料比的增加而提高，当高于50∶1时，液料比过大，传热速率下降，黄酮得率反而下降[15]。因此，初步选取最佳液料比为50∶1。

提取时间对黄酮得率的影响：图1可知，黄酮得率随提取时间增加而提高，但超过50 s后黄酮得率基本稳定，这主要由于50 s时黄酮基本提取完全，故初步选取最佳提取时间为50 s。

微波功率对黄酮得率的影响：微波功率过高，体系升温过快，容易加速黄酮的氧化与降解。由图1可知，随着微波功率的增加，黄酮得率减少，在低火144W时达到最大值。故选取最佳微波功率为低火144 W。

图1 单因素提取实验结果

2.1.2 响应面优化黄酮提取结果及分析

根据1.2.2方法及单因素实验结果，以黄酮得率为响应值，以乙醇浓度80%和微波功率低火144 W为固定值，对磷酸氢二钾用量、液料比、提取时间3因子在3水平进行响应面分析优选。表1为响应面实验因素水平表。响应面实验结果见表2。

表1 3因子在3水平微波提取响应面分析实验因素水平表

方差分析：采用Designexpert程序对表2所得数据进行回归分析，回归实验结果见表3。从表3中可以看出，液料比(A)的P值小于0.05大于0.01，说明液料比对高粱酒糟黄酮的提取影响显著，磷酸氢二钾用量(B)的P值小于0.01，说明磷酸氢二钾用量对高粱酒糟黄酮的提取影响极显著。方差分析说明各个实验因子对高粱酒糟黄酮的提取影响由大到小的顺序依次为：磷酸氢二钾用量(B)、液料比(A)、提取时间(C)。方差分析也说明各个具体实验因子与响应值都不是简单的线性关系。

表2 3因子在3水平响应面分析结果

表3 方差分析

拟合模型的建立：对响应面测试数据进行回归拟合，确立如下回归方程：Y=+1.92-0.071A-0.100B+0.053C+0.078AB+0.048AC-0.076BC-0.170A2+8.500E-004B2-0.013C2。由表3可知，模型的P<0.05(显著)，失拟项检验的P=0.121 3(不显著)，表明模型充分拟合实验数据，该方程是高粱酒糟黄酮的得率与提取工艺参数的合适数学模型。

交互作用分析：在液料比、磷酸氢二钾用量、提取时间3个因素中任取两个作为X和Y，以黄酮得率作为Z，作出相应的三维曲面图。相比而言，液料比(A)和磷酸氢二钾用量(B)的交互作用较大，如图2，表现为曲线比较陡，这与回归分析的结果吻合。

图2 三维曲面和回归模型等值线

最优工艺条件确定与模型验证：利用软件绘出回归模型的等值线(见图2)，并确定模型的极大值点，预测所得最大黄酮含量为2.159%。利用软件得出黄酮提取的最优条件：在低火微波功率和乙醇浓度80%条件下，磷酸氢二钾用量9 g/50 mL(即180 mg/mL)、提取时间60.00 s、液料比47.00 mL·g-1。根据实际最优工艺进行验证实验，在此条件下测定黄酮得率，平行3次，得最大得率为2.16%，实验结果与预测值无显著差异，符合实验预期，验证了模型的有效性。

李云龙等[16]采用乙醇回流提取法提取苦荞酒糟黄酮，黄酮得率为1.642%；龙谋等[17]采用超声辅助乙醇法提取苦荞红曲保健酒的酒糟黄酮，黄酮得率为1.828 %；王兴东等[18]实验结果表明，茅台酱香型酒糟中总黄酮质量分数为2.040%。本研究测得高粱酒糟较其他酒糟黄酮含量高。

2.2 黄酮纯化实验结果与分析

实验结果表明，一级双水相体系提取后再进行二级双水相体系纯化，高粱酒糟黄酮纯度由47.12%增加到82.58%，分配系数由11.40增加到30.70。高粱酒糟黄酮的纯度和分配系数分别提高1.8倍、2.7倍。利用多级双水相体系纯化制备高纯度高粱酒糟黄酮切实可行。

2.3 黄酮抗氧化实验结果与分析

以VC作为阳性对照，测定高粱酒糟粗黄酮、高粱酒糟纯化黄酮对DPPH·的清除率，实验结果见图3。根据图3的量效关系，得到浓度和清除率的线性方程及清除率为50%时所需的浓度(IC50)，见表4。表4表明，VC、高粱酒糟粗黄酮、高粱酒糟纯化黄酮在实验浓度范围内与清除DPPH·自由基呈现出良好的量效关系，其IC50分别为11.11 、56.47、47.98 μg/mL。高粱酒糟黄酮的抗氧化活性弱于VC(P<0.05)；纯化黄酮的抗氧化活性明显强于粗黄酮(P<0.05)，跟其他研究结果一致[19,20]。

表4 高粱酒糟黄酮清除DPPH·自由基的能力

图3 黄酮清除DPPH·自由基的能力比较

3 结论

通过微波协同双水相提取高粱酒糟黄酮，并用响应面实验得到最佳提取条件：乙醇体积分数80%、磷酸氢二钾质量浓度180 mg/mL、液料比47∶1、微波功率低火、提取时间60 s，得率为2.16%；二级双水相纯化，纯度可达82.58%。高粱酒糟黄酮的抗氧化活性弱于VC，二级双水相纯化有利增强抗氧化活性。微波协同双水相法制备高粱酒糟黄酮得率和纯度都较高，快速高效，安全便捷。