黑麦籽粒多酚提取工艺优化及其成分鉴定

靳明凯 杨文平 郝教敏 高志强 杨珍平 樊玮鑫

(山西农业大学食品科学与工程学院1，太谷 030801)(华北理工大学生命科学学院2，唐山 063210)(山西农业大学农学院3，太谷 030801)(山西农业大学实验教学中心4，太谷 030801)

谷物中含有丰富的植物多酚，可从籽粒与麸皮中提取，具有潜在的经济价值。超临界二氧化碳萃取法(SFE-CO2)提取效率高，能耗较少，最大限度保持物质的天然特性，已广泛的应用于各个领域[1]。YESSICA等[2]研究表明超临界萃取法是燕麦多酚提取的新方法，在38 MPa和55 ℃下，多酚的产量最高，且可获得18.2 μg/g C6～C1结构的多酚(香兰素和香草醛)和1 389 μg/g C6～C3结构的多酚(咖啡、芥子、香豆酸和阿魏酸)。顾仁勇等[3]对八月瓜多酚提取工艺比较，发现超临界CO2萃取结果优于传统提取工艺。黑麦(SecalecerealeL.)又称裸麦、黑小麦，为禾本科黑麦属1年生草本植物，抗寒能力强，广泛种植于华北地区。山西农业大学20世纪90年代引进驯化并推广的加拿大黑麦品种“4R”在山西晋中地区种植，表现生态适应性强，茎叶长势良好，籽粒营养丰富[4]，作为当地的推广品种，对优化山西农业种植结构调整具有重要作用。黑麦的膳食纤维含量最高，同时含有广泛的生物活性化合物[5，6]，其中酚类化合物是黑麦中最主要、最具多样性的一类植物化学物质，如全麦黑麦富含烷基间苯二酚(36～320 mg/100 g谷物)、酚酸(103～300 mg/100 g谷物)和木质素(2 mg/100 g谷物)[7]。黑麦多酚具有较强的清除亚硝酸盐能力[8]，良好的抗脂肪、蛋白氧化能力及抑菌性[9,10]，在改善或不降低产品品质的前提下提高产品货架期。作为一种天然抗氧化剂，黑麦多酚具有替代合成抗氧化剂(0.02% BHT)、生产功能改良的健康肉制品的较大潜力。高效液相色谱与质谱联用(HPLC-MS)在植物化学物质分析鉴定中被广泛使用[11]。目前黑麦多酚的提取主要是传统有机溶剂浸提[12]，采用超临界二氧化碳萃取法的报道相对较少。本实验以引进驯化的加拿大黑麦品种“4R”的籽粒为原料，研究响应面优化超临界CO2萃取技术提取黑麦籽粒多酚工艺条件，并运用HPLC-MS正负离子扫描法对黑麦籽粒多酚提取液中主要成分进行结构鉴定，为黑麦深加工及黑麦多酚天然抗氧化剂的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑麦(SecalecerealeL.)，引进驯化的加拿大的“4R”品种，由山西农业大学农学院提供。

乙醇、无水碳酸钠均为分析纯；福林酚、没食子酸均为生物试剂；甲醇、乙腈、正己烷等试剂均为色谱纯；二醇基(Diol)固相萃取柱。

1.2 仪器与设备

HCP-100华晨高速多功能粉碎机，WFJ2100型可见分光光度计，SFT-110超临界CO2萃取仪，DC150-1B氮吹仪，UltiMate3000高效液相色谱仪，LTQ XLTM线性离子阱质谱仪，ASE-24固相萃取装置。

1.3 方法

1.3.1 黑麦籽粒多酚提取工艺

1.3.1.1 标准曲线的绘制

配制0.05 mg/mL没食子酸标准溶液，依次吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL标准溶液于8支25 mL具塞比色管中，各管分别用50%乙醇补至3.5 mL，加1 mL福林酚试剂，摇匀、静置 3 min；用0.05 g/mL碳酸钠溶液定容，摇匀、避光静置15 min后，765 nm波长下测定吸光值A。根据吸光值绘制标准曲线，得回归方程：Y=4.590 5x+0.024 8(R2=0.997 9)，回归方程整体拟合，数据可靠。

1.3.1.2 黑麦籽粒多酚提取与测定

黑麦晒干后粉碎、过80目筛。称取3 g 黑麦籽粒粉末于400目尼龙筛绢并装入萃取釜中，旋紧密封，设置温度和压力，打入夹带剂，CO2加压到指定压力值，开始静态萃取。萃取结束后取收集瓶收集10 min，氮吹30 min挥发掉残留夹带剂。70%乙醇复溶，取1 mL 上清液，按照1.3.1.1的测定方法测定样品中多酚含量，利用标准曲线回归方程，按公式计算黑麦籽粒多酚得率：

黑麦多酚得率(mg/g)=C×X×V/m

式中：C为黑麦籽粒多酚质量浓度/mg/mL；X为稀释倍数；V为提取液体积/mL；m为样品质量/g。

1.3.1.3 单因素实验

以黑麦籽粒粉末为原料，采用超临界CO2萃取法，研究夹带剂种类对黑麦籽粒多酚得率的影响；在萃取时间2.5 h、压强4 350 psi和萃取温度55 ℃条件下，考察料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8 g/mL)对多酚得率的影响；在料液比1∶4 g/mL、压强4 350 psi和萃取温度55 ℃条件下，考察萃取时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3 h)对多酚得率的影响；在料液比1∶4 g/mL、萃取时间2 h和萃取温度55 ℃条件下，考察压强(3 625、4 350、5 080、5 800、6 530 psi)对多酚得率的影响；在料液比1∶4 g/mL、萃取时间2 h和压强4 350 psi条件下，考察萃取温度(40、45、50、55、60 ℃)对多酚得率的影响。

1.3.1.4 响应面因素水平设计

根据单因素实验结果，在每组最佳条件的附近选值。由于仪器条件要求夹带剂用量不宜超过5%，因此料液比选用1∶4 g/mL，利用Design Expert 8.0软件Box-Behnken设计原理，以萃取温度、压强、时间3个因素为自变量，以黑麦多酚得率为响应值，进行三因素三水平响应面实验。因素水平编码见表1。

表1 响应面分析的因素水平

1.3.2 黑麦籽粒多酚成分鉴定

1.3.2.1 样品的纯化

根据最佳工艺提取黑麦籽粒多酚，纯化方法参照LS/T 6119—2017并进行修改，二醇基固相萃取柱(6 mL，500 mg)依次用10 mL甲醇和10 mL正己烷活化，流速为2.0 mL/min。准确称取2 g试样溶于6 mL正己烷中，将该溶液以1.0 mL/min流速过二醇基固相萃取柱，10 mL正己烷淋洗萃取柱，弃去淋洗液，10 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，弱氮气吹干，残渣溶于5 mL 50%甲醇溶液中，涡旋振荡1 min，-18 ℃冷冻16 h，4 ℃下10 000 r/min离心5 min后取上清液，待测。

1.3.2.2 高效液相色谱(HPLC)条件

表2 液相条件优化

色谱柱：EchpsePlusC18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL；流动相A：0.1%甲酸水；B：乙腈；流动相梯度洗脱程序见表2。

1.3.2.3 质谱(MS)条件

离子源：ESI；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：100 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气(N2)流量：800 L/h；锥孔气(N2)流量：50 L/h；检测模式：多反应检测(MRM)。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 2013和Origin 2017软件进行数据处理与绘图；SPSS22软件进行方差分析、SNK法多重比较；Design Expert 8.0软件进行响应面优化。每组实验重复3次，实验结果用X±σ表示。

2 结果与分析

2.1 黑麦籽粒多酚提取工艺结果分析

2.1.1 单因素实验结果分析

以CO2静态萃取，在萃取压力4 350 psi、萃取温度55 ℃、料液比1∶4 g/mL、时间2.5 h、分离时间10 min的条件下，选择乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、环己烷、正己烷、乙酸乙酯、石油醚为夹带剂，不添加夹带剂为对照，黑麦籽粒多酚得率见表3。

表3 夹带剂种类对黑麦籽粒多酚得率的影响

少量夹带剂(携带剂、改性剂)能够显著改变超临界流体的极性，从而选择性改变提取物，这种方式大大拓宽超临界在植物功能因子的应用范围[13]。对于极性较强的多酚黄酮类化合物，仅仅使用SC-CO2萃取效率不高，由于CO2是非极性分子，根据相似相溶原理，超临界CO2萃取的产物多为非极性的含脂质混合物、挥发油等。通过适当加入乙醇、甲醇等作为夹带剂以增强其溶解力和选择性，使极性强、分子量大的物质被萃取出来。从表4可知，黑麦籽粒多酚提取得率效果较好的夹带剂依次是甲醇、95%乙醇、无水乙醇，极性较强的有机溶剂对黑麦中多酚有较强的溶解能力，多酚得率也随之增大。但是考虑到甲醇对人体的毒性作用，后续研究选择95%乙醇作为夹带剂。

其他各单因素对黑麦籽粒多酚得率的影响见图1。

注：小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。图1 料液比、萃取时间、压强和温度对黑麦籽粒多酚得率的影响

料液比在1∶1～1∶6 g/mL范围内，随着夹带剂增加，黑麦多酚得率显著提高(P<0.05)，这是由于夹带剂乙醇的加入使超临界CO2流体对黑麦多酚的溶解度增加，起到了提携作用，提高了多酚得率。当料液比为1∶6 g/mL时，黑麦籽粒多酚得率达到最大；随夹带剂添加量继续增大，黑麦籽粒多酚萃取得率显著降低(P<0.05)，这可能是乙醇加入过多使超临界CO2溶解度饱和所致。当料液比超过1∶4 g/mL后，经氮吹后的收集瓶中就没有夹带剂残留，因此，选择料液比1∶4 g/mL萃取黑麦籽粒多酚。

萃取时间在0.5～2 h范围内，随着时间延长，黑麦籽粒多酚得率显著增加(P<0.05)。当萃取时间为2 h时，黑麦籽粒多酚得率最大。继续延长提取时间，黑麦籽粒多酚得率开始下降，可能是由于温度和压力的协同作用对其中的多酚物质造成破坏。因此萃取时间以2 h为宜。

超临界流体在一定条件下，密度和介电常数可随着压力增大而增加。当到达一定压力后，溶解能力随着压力增加而减小。如图1所示，在3 625～5 080 psi范围内，随着压强增加，黑麦籽粒多酚得率显著增加(P<0.05)。当压强达到5 080 psi时，黑麦籽粒多酚萃取得率达最高值。继续加大压强，黑麦籽粒多酚得率开始显著下降(P<0.05)，这是由于萃取压力过高，导致CO2分子、乙醇分子及其他成分出现凝聚现象而导致溶解性能降低，使提取率降低[14]。因此，最适萃取压强以5 080 psi为宜。

萃取温度在40～55 ℃范围内，随着温度升高，黑麦籽粒多酚得率显著增加(P<0.05)，当温度达到55 ℃时，黑麦籽粒多酚得率达到最大值。这是由于温度的升高加快了分子热运动，提高了分子间相互碰撞几率，增加了溶质挥发性及溶剂扩散系数，加快了多酚物质的溶出[15]。继续提高萃取温度，黑麦籽粒多酚得率出现下降趋势，这可能是由于温度升高的同时，降低了CO2的密度使物质溶解度降低而降低了多酚得率[16]，另一方面高温会破坏萃取物的结构，引起蛋白质质构化、多酚类化合物部分氧化，使黑麦籽粒多酚含量降低。因此，选择55 ℃作为超临界CO2的萃取温度。

2.1.2 响应面法实验结果与分析

响应面法优化超临界萃取黑麦籽粒多酚的实验结果见表4。利用响应面设计软件对表4数据进行二次项式回归拟合，得回归模型方程：

Y=0.19+0.016A+0.030B+0.017C-0.002 2AB-0.025AC-0.009 2BC-0.042A2-0.045B2-0.038C2，R2=0.986 9。

式中：Y为黑麦籽粒多酚得率，A、B、C分别为萃取温度、萃取压强和萃取时间。

表5 回归模型的方差分析

由表5还可以看出，因素B、二次项A2、B2、C2对响应值影响达到0.001的极显著水平，因素A、C、交互项AC和BC对响应值影响显著(P<0.05)，交互项AB对响应值影响不显著(P>0.05)；三因素的偏回归系数的绝对值大小依次是|B|>|C|>|A|。表明影响黑麦籽粒多酚得率的主要因素是萃取压强B，其次是萃取时间A和萃取温度C；萃取时间和温度(AC)以及萃取时间和压强的交互作用(BC)均对黑麦籽粒多酚得率有显著影响(P<0.05)。各因素交互作用对黑麦籽粒多酚得率影响的响应面图见图2。

从图2可以看出，黑麦籽粒多酚得率随着压强、温度的增加而呈现先上升后下降的趋势；萃取压强对黑麦籽粒多酚得率的影响更大，但两因素的交互作用不明显。当萃取温度、时间增加时，黑麦籽粒多酚得率呈现先增加后减少的趋势，两者交互作用明显。当压强、时间增加时，黑麦籽粒多酚得率呈现先增加后减少的趋势；萃取压强的响应面坡度更大，说明其对多酚得率的影响程度比萃取时间更明显，同时两者交互作用明显。

2.1.3 最优提取工艺的确定及验证

响应面法得到超临界CO2萃取黑麦籽粒多酚工艺的最优工艺为：夹带剂95%乙醇、料液比1∶4 g/mL、萃取压强5 230 psi、萃取时间2.07 h、萃取温度55.65 ℃，此时黑麦籽粒多酚得率为0.200 7 mg/g。按照此工艺参数进行3次验证性实验，测得黑麦籽粒多酚得率平均为0.201 mg/g，与预测值接近，该模型较好地反映了各因素对黑麦籽粒多酚得率的影响。

图2 萃取温度、压强和时间之间两两互作的响应面图

2.2 黑麦籽粒多酚成分鉴定结果与分析

根据黑麦籽粒多酚样品的HPLC-MS正负总离子流图(图略)可知，黑麦籽粒多酚主要组分有9种，见表6，其中样品中组分4、5的含量与其他组分含量相比相对较多。

表6 黑麦籽粒多酚主要组分

黑麦籽粒多酚组分2的一级质谱扫描结果见图3。正离子扫描模式下的准分子离子峰[M+H]+质荷比(m/z)为359，因此可知化合物的分子质量为358，初步推测其中含有的化合物为罗汉松脂酚(matairesinol)(表6)。此数据与文献的质谱数据一致[17]。

图3 黑麦籽粒多酚组分2的一级质谱分析

黑麦籽粒多酚组分4、5的一级质谱扫描结果分别见图4、图5。从图4可知，正离子扫描模式下的准分子离子峰[M+H]+质荷比(m/z)为433，因此可知化合物的分子质量为432，初步推测其中含有的化合物为二十三烷基间苯二酚(tricosylresorcinol)(表6)；从图5可知，正离子扫描模式下的组分5有3个主要的峰，其中准分子离子峰[M+H]+质荷比(m/z)为459；加钠峰[M+Na]+的m/z为481；加钾峰[M+K]+的m/z为497，因此可知化合物的分子质量为458，初步推测其中含有的化合物为二十五烷基间苯二酚(pentacosenylresorcinol)(表6)。此数据与文献的质谱数据一致[18]。

黑麦籽粒多酚组分7的一级质谱扫描结果见图6。正离子扫描模式下的组分7有两个主要的峰，其中准分子离子峰[M+H]+的质荷比(m/z)为679.61；加钠峰[M+Na]+的m/z为701.59。因此初步推测其中含有的化合物为β-谷甾醇油酸酯(sitosteryl-18∶1)(表6)，分子质量为678。此数据与文献的质谱数据一致[19]。

图4 黑麦籽粒多酚组分4的一级质谱分析

图5 黑麦籽粒多酚组分5的一级质谱分析

图6 黑麦籽粒多酚组分7的一级质谱分析

本研究推测出黑麦籽粒多酚中含有两种烷基间苯二酚(ARs)，一种木脂素和一种植物甾醇。烷基间苯二酚具有抑菌(革兰氏阳性菌)、提高生物膜的稳定性、抗肿瘤、抗氧化等生物活性作用[20，21]；罗汉松脂酚为木脂素类成分，有抗肿瘤、抗氧化活性，抗氧化活性比VC更强，因为其含有甲氧基的芳香环[22，23]；β-谷甾醇油酸酯具有β-谷甾醇所有的优良性能，如抗氧化、抗炎作用，能够抑制人体对胆固醇的吸收，能减轻非酒精性脂肪肝大鼠高脂饮食引起的肝脂肪变性[24，25]。烷基间苯二酚是黑麦中含量最丰富的酚类化合物之一，几乎只存在于黑麦和小麦的麸皮中，因此被认为是全麦黑麦和小麦摄入量的生物标志物[26]。NYSTRO等[27]报道黑麦中烷基间苯二酚总含量为796～1 231 μg/g，在法国的Nikita、Rekrut和Queyras3个品种中含量最高，Grandrieu品种中含量最低。烷基间苯二酚主要的同系物有5种，C17∶0 22%～28%、C19∶0 32%～34%、C21∶0 21%～27%、C23∶0 9%～11%和C25∶0 8%～10%。ROSS等[28]和EVANS等[29]分别测得的黑麦中烷基间苯二酚的总含量为568～1 022 μg/g和3 220 μg/g。这些差异可能与品种和农业气候条件的不同有关。本研究未对所选用的黑麦品种中含有的多酚化合物含量进行检测，后续研究会选择不同品种进行相关定量分析和作用研究。

3 结论

采用响应面法优化超临界CO2萃取法(SFE-CO2)提取黑麦籽粒多酚，得出最优提取工艺为：夹带剂95%乙醇，料液比1∶4 g/mL，萃取压强5 230 psi，萃取时间2.07 h，萃取温度55.65 ℃，此条件下黑麦籽粒多酚得率为0.201 mg/g。经高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术初步推测出黑麦籽粒多酚中含有罗汉松脂酚、二十三烷基间苯二酚、二十五烷基间苯二酚、β-谷甾醇油酸酯4种化合物。