CD10、Nestin蛋白在皮肤附属器肿瘤组织中的表达及意义

戎锡云

【摘要】 目的：探討白细胞分化抗原簇10（CD10）、巢蛋白（Nestin）在皮肤附属器肿瘤组织中的表达及意义。方法：收集2018年1-12月本院收治的40例皮肤附属器肿瘤患者的肿瘤组织标本，另选择5例乳腺癌根治手术切除标本中远离肿瘤的皮肤为正常皮肤对照。免疫组织化学标记CD10、Nestin蛋白，观察各例肿瘤CD10、Nestin蛋白的表达情况、阳性细胞的类型和分布。结果：汗腺肿瘤、毛分化肿瘤及皮脂腺肿瘤中的CD10蛋白表达情况比较，差异有统计学意义（P=0.000），但Nestin蛋白的表达情况比较差异无统计学意义（P=0.277）。CD10在正常皮肤的皮脂腺、汗腺周围的肌上皮细胞呈阳性表达，在小汗腺和大汗腺上皮呈阴性;Nestin在正常皮肤的皮脂腺外围基底样细胞、汗腺分泌部上皮细胞呈弱阳性表达，在分化的皮脂细胞呈阴性，肌上皮细胞阳性表达。多数类型汗腺肿瘤CD10阴性，部分病例显示瘤细胞胞质内CD10阳性表达。汗管瘤的Nestin为阴性;螺旋腺瘤肌上皮部分Nestin阳性。透明细胞汗腺瘤腺腔样结构腔膜缘细胞显示Nestin颗粒状阳性。乳头状汗腺腺瘤肌上皮细胞Nestin阳性。多数类型毛分化肿瘤表达CD10及Nestin：毛母细胞瘤间质细胞CD10阳性表达，Nestun弱阳性;毛母质瘤瘤细胞CD10阳性，Nestin阳性;毛囊瘤瘤细胞CD10阳性，角化细胞Nestin阳性。皮脂腺瘤和皮脂腺癌的CD10多呈阳性表达，各例皮脂腺瘤和皮脂腺癌的Nestin表达类似，多显示为阴性或呈弱阳性表达，部分病例显示个别瘤细胞胞质内颗粒状阳性表达。结论：CD10是毛分化、皮脂腺分化皮肤附属器肿瘤的特异性标记物，干细胞标记物Nestin在这些肿瘤的表达方式可以作为肿瘤成分分化特点的参考。

【关键词】 白细胞分化抗原簇10 巢蛋白 皮肤附属器肿瘤

Expression and Significance of CD10 and Nestin Proteins in Skin Adnexal Tumors/RONG Xiyun. //Medical Innovation of China， 2020， 17（22）： -141

[Abstract] Objective： To investigate the expression and significance of CD10 and Nestin in skin adnexal tumors. Method： From January 2018 to December 2018， 40 cases of skin adnexal tumors were collected and

5 cases of breast cancer were selected as normal skin control. Immunohistochemistry was used to label CD10 and Nestin protein. The expression of CD10 and Nestin protein， the type and distribution of positive cells were observed. Result： The expression of CD10 protein in sweat gland tumors， hair-differentiated tumors and sebaceous gland tumors was significantly different （P=0.000）， but the expression of Nestin protein was not significantly different （P=0.277）. CD10 was positive in sebaceous glands and sweat glands of normal skin， but negative in eccrine glands and apocrine glands; Nestin was weak positive in basal-like cells and sweat gland secretory epithelial cells of normal skin， but negative in differentiated sebaceous cells and positive in myoepithelial cells. CD10 was negative in most types of sweat gland tumors， and positive expression of CD10 in cytoplasm was found in some cases. Nestin was negative in syringoma and positive in myoepithelial part of spiral adenoma. Nestin granular positive cells were found in the lumen-like structure of clear cell sweat adenoma. Nestin was positive in myoepithelial cells of papillary sweat adenoma. CD10 and Nestin were expressed in most types of hair-differentiated tumors： stromal cells were CD10 positive， Nestun was weak positive; hair-derived tumors were CD10 positive， but not nestin positive; hair follicle tumors were CD10 positive and keratinocytes were Nestin positive. CD10 expression was positive in sebaceous adenoma and sebaceous adenocarcinoma. The expression of Nestin was similar in sebaceous adenoma and sebaceous adenocarcinoma， but negative or weak positive in most cases. Some cases showed granular positive expression in cytoplasm of individual tumors. Conclusion： CD10 is a specific marker of dermal adnexal tumors with hair differentiation and sebaceous gland differentiation. The expression pattern of stem cell marker Nestin in these tumors can be used as a reference for the differentiation of tumor components.

[Key words] Leukocyte differentiation antigen cluster 10 Nestin Skin adnexal tumors

First-authors address： Shanwei Peoples Hospital， Shanwei 516600， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.22.036

皮肤附属器肿瘤是一大类形态上分化起源于皮肤附属器结构的良、恶性肿瘤，这类肿瘤形态多变，在临床上较为罕见。皮肤附属器结构包含毛囊、皮脂腺、汗腺等，各类结构在胚胎发育、解剖位置及形态上均不相同。临床上，主要是根据分化起源不同可将其分类，主要为汗腺分化肿瘤、毛囊分化肿瘤或皮脂腺分化性肿瘤[1-2]，也有少部分为错构瘤或混合瘤（如皮脂腺痣）。由于皮肤附属器肿瘤的种类较多，分类也十分复杂，临床及病理诊断较为困难。此外，临床显示，皮肤附属器肿瘤的侵袭性较强、患者预后差，因此，及时、准确地鉴别肿瘤类型并给予对症治疗对与患者的病情控制及改善预后至关重要。目前，临床皮肤肿瘤病理检查的工作中，常通过检测各类疾病相关的免疫标志物来辅助鉴别诊断[3]。近些年，通过临床验证，肿瘤特异性分子标志物的诊断准确性、有效性已得以大幅提升，尤其免疫组化的有效运用显得愈发重要[4]。然而对于部分形态不典型、组织学特征有重叠的疑难皮肤附属器肿瘤病例，采用免疫组化标记鉴别诊断该类疾病具有一定的局限性[5]。因此，分析更多新标记物对皮肤附属器肿瘤的诊断价值对于鉴别诊断疾病具有重要的积极意义。本文观察了白细胞分化抗原簇10（Cluster of Differentiation 10，CD10）和巢蛋白（Nestin）在皮肤附属器肿瘤组织中的表达情况，探讨其对于皮肤附属器肿瘤诊断和鉴别诊断中的意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本院2018年1-12月40例皮肤附属器肿瘤患者的肿瘤组织标本。纳入标准：患者均经病理诊断证实为皮肤附属器肿瘤;皮损部位分布于头面部、颈部、躯干及四肢;入组前未经任何治疗。排除标准：合并其他肿瘤者;临床资料不完整者。男18例，女22例;年龄33～71岁，平均（51.61±6.38）岁。参照世界卫生组织（WHO）皮肤肿瘤遗传学和组织学分类（2006年版）中的标准[6]，40例皮肤附属器肿瘤患者中，汗腺肿瘤15例，毛分化肿瘤18例，皮脂腺肿瘤7例，上述诊断均由两名以上高年资病理医生复核并确定。另选择5例乳腺癌根治手术切除标本中远离肿瘤的皮肤为正常皮肤对照，其中男2例，女3例;年龄45～63岁，平均（52.20±6.72）岁。本研究经汕尾市人民医院道德伦理委员会批准。

1.2 主要試剂 本研究中所使用的鼠抗人CD10单克隆抗体（克隆号：56C6）、柠檬酸钠抗原修复液均购自上海长岛生物公司，鼠抗人巢蛋白（Nestin）单克隆抗体均（克隆号：10C2）以及免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本处理 将所有组织标本采用4%中性缓冲福尔马林固定后使用梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋。采用YGQ-2158型病理切片机将包埋好的组织蜡块切成约4 μm厚度的组织切片，置于预先处理好的载玻片上，放入60 ℃温箱内过夜，使组织与载玻片贴合紧密，备免疫组织化学用。HE组织切片：石蜡组织标本常规4 μm厚度的连续切片，烤片机上65 ℃烤片2 h，后放入40 ℃温箱过夜。

1.3.2 HE染色步骤 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后自来水冲洗2 min，接着加入苏木素染色5 min，加入1%盐酸酒精分化20 s后加入1%稀氨水反蓝，自来水冲洗1 min后伊红复染2 min，自来水冲洗45 s。将染色后的切片以纯酒精脱水后吹干，中性树胶封片。

1.3.3 免疫组织化学染色步骤 免疫组织化学染色采用En Vosion二步法，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，3% H2O2（10 min）去除内源性过氧化物酶，采用柠檬酸钠抗原修复液进行抗原修复，PBS冲洗后加入CD10一抗，4 ℃冰箱过夜，次日取出切片以PBS溶液浸泡3遍，甩去PBS液后滴加二抗工作液，室温孵育15 min，PBS溶液浸泡3遍后甩去PBS液，滴加DAB显色剂，显微镜控制显色，苏木素复染1 min，加入1%盐酸酒精分化20 s，自来水冲洗后热水冲洗使其返蓝，梯度酒精脱水后吹干，中性树胶封片。

1.3.4 对照设计 设置阴性及阳性对照，所有抗体均在实验前配制，抗体孵育、显色的温度及时间均固定，结果判定采用单盲法，取正常人皮肤（含正常汗腺组织和毛囊）作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 观察指标及判定标准 观察各例正常皮肤组织及皮肤附属器肿瘤CD10、Nestin的表达情况，重点观察阳性细胞的类型和分布。CD10、Nestin的标记阳性部位均为细胞质，以细胞胞质清晰显示棕黄色颗粒的阳性细胞数占总细胞数比例作为评判标准，即：无阳性细胞或阳性细胞数<10%为阴性（-），10%～25%弱阳性（+），26%～50%为中等阳性（++），>50%为强阳性（+++）。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料均以率（%）表示，分类资料比较采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD10、Nestin蛋白在皮肤附属器肿瘤的表达情况 CD10在汗腺肿瘤中多为阴性表达13例（86.67%），在毛分化肿瘤、皮脂腺瘤中多为弱阳性或中等阳性表达16例（88.89%）、5例（71.43%），1例皮脂腺肿瘤出现CD10强阳性表达。Nestin在汗腺肿瘤、毛分化肿瘤中呈弱阳性或中等阳性表达11例（73.34%）、16例（88.89%），而在皮脂腺肿瘤中多为阴性或弱阳性表达5例（71.34%）。统计学结果显示，汗腺肿瘤、毛分化肿瘤及皮脂腺肿瘤中的CD10蛋白的表达比较，差异有统计学意义（字2=21.799，P=0.000）;但Nestin蛋白的表达在汗腺肿瘤、毛分化肿瘤及皮脂腺肿瘤中比较，差异无统计学意义（字2=2.565，P=0.277）。见表1、2。

2.2 CD10和Nestin在正常皮肤附属器的表达 40例皮肤附属器肿瘤标本中11例附带正常皮肤组织，观察其与另5例正常皮肤对照发现，CD10在正常皮肤的皮脂腺呈阳性表达，在汗腺周围的肌上皮细胞中也呈阳性表达，而在小汗腺和大汗腺上皮呈阴性;Nestin在正常皮肤的皮脂腺外围基底样细胞呈弱阳性表达，在分化的皮脂细胞呈阴性，汗腺分泌部上皮细胞弱阳性表达，肌上皮细胞阳性表达。见图1、2。

2.3 各皮肤附属器肿瘤种CD10、Nestin蛋白的分布情况 各类肿瘤的CD10及Nestin蛋白的表达并不完全一致，并且阳性表达部位也有各自特点。40例皮肤附属器肿瘤中有15例属于汗腺肿瘤，占比为37.50%，包含汗管瘤、螺旋腺瘤、透明细胞汗腺瘤及乳头状汗腺腺瘤，多数类型汗腺肿瘤CD10阴性，部分病例显示瘤细胞胞质内CD10阳性表达，汗管瘤的Nestin为阴性，螺旋腺瘤肌上皮部分Nestin阳性，透明细胞汗腺瘤腺腔样结构腔膜缘细胞显示Nestin颗粒状阳性，乳头状汗腺腺瘤肌上皮细胞Nestin阳性。毛分化肿瘤有18例，占比为45.00%，包含毛母细胞瘤、毛母质瘤及毛囊瘤，多数类型毛分化肿瘤表达CD10及Nestin：毛母细胞瘤间质细胞CD10阳性表达，Nestin弱阳性;毛母质瘤瘤细胞CD10阳性，Nestin阳性;毛囊瘤瘤细胞CD10阳性，角化细胞Nestin阳性。皮脂腺分化肿瘤7例，占比为17.50%，包括皮脂腺瘤和皮脂腺癌，皮脂腺瘤和皮脂腺癌的CD10多呈阳性表达，各例皮脂腺瘤和皮脂腺癌的Nestin表达类似，多显示为阴性或呈弱阳性表达，部分病例显示个别瘤细胞胞质内颗粒状阳性表达。

3 讨论

皮肤附属器肿瘤依据其分化方向分类、命名，其分类较为复杂，且同一种肿瘤有时会表现出不同分化方向的形态学特点，致使在临床病理鉴别诊断工作中难以有效区分[7-9]。即便使用免疫组化技术帮助鉴别，也由于各肿瘤免疫标记表达的重叠难以确定诊断。以往文献[10-11]报道，CD10、Nestin免疫组化检测可用来区别基底细胞癌和毛母细胞瘤，CD10也是一个有价值的区分肾细胞癌转移至皮肤与伴小汗腺和大汗腺分化的皮肤附属器肿瘤的免疫标记物。近年来，探讨更多新标记物对皮肤附属器肿瘤的诊断价值，正逐渐成为热点。

CD10是一种表达于细胞表面的锌依赖金属蛋白酶，其基因位于染色体3q21～q27区。已有大量的研究显示，CD10的表达与多种肿瘤如口腔癌、基底细胞癌、恶性黑色素瘤的进展及转移密切相关[12]。肿瘤细胞的生长、浸润和转移能力与肿瘤细胞、周围的间质细胞及细胞外基质等均有关联，CD10不仅在多种正常細胞和肿瘤细胞表达，也在一些肿瘤组织的间质细胞中表达，对肿瘤的浸润和转移有影响[13]。本研究中，CD10在正常皮肤的皮脂腺呈阳性表达，在汗腺周围的肌上皮细胞中也呈阳性表达，而在小汗腺和大汗腺上皮呈阴性。在皮肤附属器肿瘤中，CD10不表达于多数类型汗腺肿瘤，仅部分病例显示瘤细胞胞质内CD10阳性表达;而在多数毛分化肿瘤及皮脂腺肿瘤中，CD10均阳性表达，提示CD10的不表达或低表达是皮肤附属器肿瘤中汗腺肿瘤的特征所在。CD10被证实表达于正常皮肤附属器周围的间质细胞和肿瘤中，文献[14-15]研究发现，CD10在毛母细胞瘤间质中强阳性表达。尽管CD10在肿瘤形成方面的作用及机制尚未明确，但其可作为一种重要的肿瘤标记物。Izikson等[16]在2005年报道，86%的毛母细胞瘤中会表达CD10，但主要是肿瘤的间质细胞表达，肿瘤细胞中仅零散表达，观察CD10的表达部位可能有助于鉴别毛母细胞瘤与基底细胞癌。然而本研究病例中，多数CD10被观察到表达于肿瘤的间质细胞，且未发现明显规律，因此难以通过CD10的表达部位来区分不同分化类型的皮肤附属器肿瘤。

Nestin最初由Hockfieid等利用单克隆抗体Rat.401识别，其表达于神经干细胞，主要分布于细胞质中，是一种主要的细胞骨架蛋白。Nestin基因定位于1q23.1，编码产物属于Ⅵ型中间丝蛋白，主要在神经和肌肉的干细胞或前体细胞中表达，随着细胞分化成熟，表达逐渐减低，分化完成后消失。Nestin最初被用于中枢神经系统胶质瘤的研究，随着研究的进展，有学者发现Nestin不仅存在于中枢神经系统的前体细胞中，在胰腺干细胞、Schwann细胞以及血管内皮细胞中均有表达[17]。近年来，在多种恶性肿瘤，如胰腺癌、乳腺癌组织中发现Nestin呈过度表达，且具有促进肿瘤的浸润转移的功能[18-19]。而当Nestin表达抑制或失活时，则能抑制肿瘤细胞迁移能力及转移瘤的形成[20]。上述研究提示Nestin在肿瘤的发生、进展过程中发挥重要的作用，是鉴别诊断肿瘤的重要标记物之一。本研究结果显示，Nestin在正常皮肤的皮脂腺外围基底样细胞呈弱阳性表达，在分化的皮脂细胞呈阴性多数类型的毛分化肿瘤中也发现不同程度表达的Nestin，位置多处于形成毛角化区域，提示Nestin强表达是毛分化肿瘤的特征之一。尽管在胚胎发育时期，毛囊与皮脂腺均共同起源于表皮生发层的原始上皮芽[21]。但本组病例显示，不表达或者低表达Nestin可能是皮脂腺分化肿瘤与毛分化肿瘤的不同之处。Nestin在汗腺分泌部上皮细胞弱阳性表达，肌上皮细胞阳性表达，本研究发现难以通过Nestin的表达情况来区分汗腺肿瘤与毛分化肿瘤或皮脂腺肿瘤。汗腺分化肿瘤可以细分为外泌汗腺肿瘤和顶泌汗腺肿瘤，本研究结果显示，Nestin在乳头状汗腺瘤中呈阳性表达，而在汗管瘤呈阴性，其可能有助于鉴别顶泌汗腺分化的肿瘤与外泌汗腺分化的肿瘤，但由于本组纳入病例数较少，对于Nestin在外泌汗腺肿瘤与顶泌汗腺肿瘤表达的意义仍需要进一步的研究。

皮肤附属器肿瘤的类型繁多，本研究探讨了CD10、Nestin蛋白在不同皮肤附属器肿瘤组织及正常皮肤组织中的表达情况，结果显示CD10是毛分化、皮脂腺分化皮肤附属器肿瘤的特异性标记物，干细胞标记物Nestin在这些肿瘤的表达方式可以作为肿瘤成分分化特点的参考，但由于病例数较少，还需要深入研究进一步确认。

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（收稿日期：2019-10-15） （本文编辑：周亚杰）