基于尿蛋白组学的CKD273在慢性肾脏病中的应用进展

徐耀　徐艳　刘昌华

【摘要】 目前，慢性肾脏病的诊断及预后缺乏准确性、敏感性，主要是受到特异性生物标志物的限制。早发现及预防并发症的发生，以提高生存率和生活质量为目标极为关键。尿液是探索肾脏疾病生物标志物的宝贵资源，近年来由于组学平台和生物信息学的迅猛发展，产生了许多关于肾纤维化的新型生物标志物的研究。基于尿蛋白质组学生物标志物的分类器CKD273与肾脏疾病和肾纤维化的严重程度有关，并已证明其在预测DKD及心血管事件的重大价值。CKD273具有肾脏病精准化治疗的里程碑意义，基于这个成功的例子，蛋白质组学有望发展成为指导精准化干预的关键技术。笔者回顾了过去10年尿蛋白质组学的重大发展，重点介绍了CKD273模型在慢性肾脏病中的应用进展。

【关键词】 尿蛋白组学 CKD273 慢性肾脏病 糖尿病肾病

Progress in the Application of CKD273 Based on Urine Proteomics in Chronic Kidney Disease/XU Yao， XU Yan， LIU Changhua. //Medical Innovation of China， 2020， 17（22）： -169

[Abstract] At present， the diagnosis and prognosis of chronic kidney disease lacks accuracy and sensitivity， mainly due to the limitation of specific biomarkers. Early detection and prevention of complications are critical to improving survival and quality of life. Urine is a valuable resource for exploring biomarkers of kidney disease. In recent years， due to the rapid development of omics platforms and bioinformatics， many new biomarkers of renal fibrosis have been produced. The CKD273 classifier based on urine proteome biomarkers is related to the severity of kidney disease and renal fibrosis， and has proven to be of great value in predicting DKD and cardiovascular events. CKD273 is a milestone in the precise treatment of kidney disease. Based on this successful example， proteomics is expected to develop into a key technology to guide precise intervention. We reviewed the major developments in urinary proteomics over the past 10 years， highlighting the application of CKD273 in chronic kidney disease.

[Key words] Urine proteomics CKD273 Chronic kidney disease Diabetic kidney disease

First-authors address： Jiangsu Province Subei Peoples Hospital， Clinical Medicine College， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.22.043

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是一个日益严重的公共卫生问题，影响全世界约17%的成年人口，65岁以上者患病率更高达20%[1]。CKD最终导致终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD），糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常见的并发症之一，也是导致CKD的最常见原因，并且与心血管疾病的发病率和死亡率密切相关。许多大规模临床研究表明，通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）系统可以保护肾功能、延缓肾脏病进展[2]，因此早期诊断CKD、延缓ESRD发生是目前研究的重点。目前，DKD早期诊断及进展评估主要基于微量白蛋白尿和肾小球滤过率估计值（estimated glomerular filtration rate，eGFR）的评估。然而，这些参数缺乏敏感性和特异性。首先，临床上一部分糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者发生肾功能损害而没有明显的白蛋白尿，其次DKD患者发病初期肾脏呈高滤过状态，当疾病进展并且50%的肾功能已经丧失时，eGFR才出现显著降低，其是疾病进展的晚期征兆。目前，基于尿蛋白质组学的飞速发展及CKD273分类器的不断完善为DKD的早期诊断和风险评估提供了新思路。

1 尿蛋白质组学的发展进程

蛋白质是生命机制的功能执行者，它们已被用作许多疾病的预后生物标志物，如DKD、心血管疾病和癌症。蛋白质组是指由生物体表达的全套蛋白质，蛋白质组学是对蛋白质组的研究。蛋白质作为遗传信息（包括环境影响）的表达结果，其水平的变化提供了有关特定疾病改变途径的信息，因此，蛋白质组学可以用来描述生物体或器官的功能状态，并为进一步研究疾病的分子机制提供途徑。蛋白组学可用各种不同的实验室技术进行研究，如二维凝胶电泳，毛细管电泳耦合电喷雾电离-质谱（CE-ESI-MS），液相色谱-耦合质谱（LC-MS）和基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）[3]。随着蛋白质分离技术和质谱的发展，基于CE-MS的蛋白质组学已被广泛应用于临床样品的分析，可用于识别组织、细胞、体液中蛋白质的变化，其具有高敏感性、高特异性和高通量等特性，能提供一般方法无法提供的有价值的疾病信息。CE-MS已被证明是一种可运用于临床的成熟蛋白质组学技术，其是迄今为止提供最多可比较蛋白质组学数据集的平台，目前有超过40 000例人尿蛋白质组数据集可供使用[4]，可实现基于>10 000个受试者的蛋白质组学研究。蛋白质组学涉及生物样品中蛋白质和多肽的大规模分离和定量，由于可同时测量多种潜在疾病的致病途径，是早期识别DKD的有前景的技术。目前蛋白质组学研究已经确定了几种与慢性肾衰有关的尿生物标志物，如α-1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，A1AT），细胞外谷胱甘肽过氧化物酶和载脂蛋白A-1[5]。

尿液是一种有价值的生物流体，正常生理条件下尿液应仅含有少量低/中分子量蛋白质，这些蛋白质含量在病理情况下发生变化。尿液一直是生物样本的首选，它经过肾脏滤过、重吸收，含有稳定的肽，无须进一步处理即可进行质谱分析，因此是用于CKD的蛋白质组学研究首选的生物样本。目前综合运用组学检测技术、生物信息学分析技术以及大数据信息平台技术的CE-MS技术是用毛细管电泳（CE）分离肽，然后通过质谱（MS）鉴定，结果存储在适当的数据库中，随后评估存储在数据库中的蛋白质组谱和临床数据，以建立和验证用于相关临床目的生物标志物，而这正是目前肾脏疾病精准医学研究的趋势。尿蛋白质组学在寻找新的早期预测CKD及诊断的特异标志物中显示出极大的临床应用潜力。

2 CKD273在CKD中的应用

基于以上技术的发展，在2010年Good等[6]研究发现，与健康对照组相比，CKD组尿液中有273种肽存在差异表达，随后其使用向量机将这273种肽组合成一种叫作CKD273的分类器，并描绘了曲线下面积（AUC）为0.96，至此，CKD273成功地将CKD患者与健康人区分开来。CKD273分类器由尿中273种差异调节尿肽组成，包括不同的胶原蛋白片段、肾特异性蛋白（钠/钾转运ATP酶γ链，膜相关孕酮受体成分1等）、血液衍生蛋白片段（例如纤维蛋白原，载脂蛋白，血红蛋白α链，纤维蛋白原α链等），其中主要是1型和3型胶原蛋白片段，但对应于源蛋白的肽如白蛋白，尿调节素和A1AT也在其中，因此可以同时反映多种疾病的致病途径[6]。

此外，Genovese等[7]通过研究表明，CKD273中各种胶原蛋白片段的修饰可能表明细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的变化，这是CKD早期肾脏损害的标志，且在肾组织纤维化期间，肾间质中瘢痕组织的形成是ECM过度增生的结果。Magalh?es等[8]检测了42个肾活检组织的纤维化程度和对应样本的尿蛋白质组学，发现7种纤维化相关肽与纤维化程度呈负相关，CKD273和特异性肽与肾纤维化显著相关。

由于目前临床上导致CKD的病因各不相同，疾病存在隐匿且发展速度不一的特点，基于eGFR或尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）标准无法准确预测CKD进展，由于缺乏早期识别CKD进展的工具以及对有效的干预措施，导致CKD已成为全球增长最快的死因之一。CKD患者的尿液排泄中包含丰富的血浆蛋白片段（人血白蛋白和纤维蛋白原），这可能反映了肾小球滤过屏障的慢性损害。一项在涵盖CKD所有阶段的研究中评估了CKD273分类器的诊断和预后价值，CKD273分类器在早期肾病[eGFR大于60 mL/（min·1.73 m2]的评估中表现优于UAER和UAER/eGFR （AUCCKD273=0.93 vs AUCUAER=0.67，AUCCKD273=0.94 vs AUCUAE/eGFR=0.91）[9]。而关

于CKD273中对于疾病进展性的预测，一项纳入了2 672例不同CKD分期患者的横断面研究显示，在疾病早期阶段，进展者eGFR下降>5 mL/（min·1.73 m2）较非进展者胶原蛋白和尿调节素片段减少;在中晚期eGFR 40～60 mL/（min·1.73 m2）进展者A1AT和人血白蛋白片段增加，而与晚期CKD eGFR<40 mL/（min·1.73m2）相关的尿肽显示出高度可变的分布，显示出CKD273分类器在预测CKD患者的肾功能方面表现出更高的稳定性[10]。此外，CKD273的预后准确性也超过了单个生物标志物，可能是与肽的生物学变异性有关[6]。

关于CKD273在临床运用的证据等级，Critselis等[11]综合分析了目前已经报道的四项前瞻性队列研究，指出CKD273可预测微量或大量白蛋白尿的发展和eGFR的快速下降（每年下降速度>5%），根据牛津循证医学（Oxford Evidence-Based Medicine，EBM）和推荐分类法（Strength of Recommendation Taxonomy，SORT）指南证据等级分别被归为1b级和1～4分，且分类器的效能与年龄、性别和所用尿液储存容器的类型无关。

Argilés等[12]对76例不同程度的CKD患者进行了尿蛋白质组的检测并进行了长达6年的随访发现，CKD273是第一个在独立队列研究中成功预测CKD进展预后的蛋白质组学分类器。随后，文献[13]将研究对象扩大到一般人群，评估了CKD273与肾功能相关的横断面和纵向关联，并且前瞻性地研究与心血管并发症的关联，认为CKD273在预测早期CKDeGFR>70 mL/（min·1.73 m2）进展的价值较高，在疾病晚期中效能降低。

鉴于胶原片段的改变是肾脏和心血管疾病进展的关键，1型和3型胶原在血管中比肾小球基底膜改变更加明显，CKD273可能不仅仅是CKD的标志物，也是心血管疾病的非特异性标志物。有报道称，尿蛋白质组学标记物可在传统危险因素不明显的人群中识别出发生CVD或死亡的高风险患者，并且为平均风险较低的人群提供更准确的风险预测，从而可以为临床决策提供依据[14]。

3 CKD273在DKD中的应用

DKD是慢性肾脏病的主要病因之一，其发展特征是尿白蛋白排泄率从无蛋白尿到微量蛋白尿再到大量蛋白尿。微量白蛋白尿（30～300 mg/24 h）被认为是目前预测DKD发展的最佳指标，然而由于个体的差异性，其在临床上的准确性受到很大影响。有报道称，近半數的Ⅰ型糖尿病患者并未检测出明显的白蛋白尿，然而肾功能已受到严重损害，这表明白蛋白尿缺乏敏感性[15]。目前，CKD273分类器已被证实与正常白蛋白尿患者进展为微量白蛋白尿（microalbuminuria，MA）有关[16]，早期识别可能进展为微量白蛋白尿的个体对DKD的早期治疗有重要意义。已有研究表明，包括胶原蛋白片段、α-微球蛋白、β2-微球蛋白、A1AT、尿调节素等尿肽是一种有前途的生物标志物组，可用于早期检测T2DM患者发展至DKD阶段[16]。基于尿胶原片段与肾功能相关的多个观察结果，有学者认为在CKD尤其是在DKD中，生理性胶原蛋白降解减弱，这导致ECM中的胶原蛋白增加和纤维化，使得CKD273能够检测具有进展至DKD的风险的糖尿病患者，而与尿白蛋白浓度无关[17]，其为早期诊断非蛋白尿糖尿病肾病（normoalbuminuric diabetic kidney disease，NADKD）带来了新希望[18]。

最近的横断面研究检测了155例2型糖尿病患者的MA并用CE-MS进行蛋白质组学分析以测定CKD273分类器评分，并以全因死亡率作为终点进行6年的随访，结果显示在Cox回归模型中UAER（β=0.402，P<0.001）和eGFR（β=-0.184，P=0.039）是CKD273的决定因素[19]，而UAER和eGFR已被证实是DKD和一般人群心血管事件和死亡率的独立预测因子[20]。除了预后价值外，有研究发现厄贝沙坦在DKD中治疗两年后CKD273评分发生显著改变且与健康人相近[21]。此外，在一项名为PRIORITY的国际多中心临床试验和观察性研究中，该分类器被证明可用于监测DKD患者管理并进行危险程度分层，此外，该实验还阐明了早期检测糖尿病肾病与螺内酯治疗相结合的潜在益处[22]。另外，在早期检测DKD进行特异性治疗的效用目前正在进行多中心的前瞻性试验[23]。

4 其他肾脏病中的应用

尿蛋白质组学同样也应用于其他肾脏病领域，例如狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）或常染色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）。血管紧張素Ⅱ-调节蛋白在离体肾组织被发现，并且在体内的动物肾脏模型中得到验证。有学者发现，相比于与非ADPKD肾脏病，其在ADPKD患者中的尿排泄率较低，考虑可能与囊肿导致的肾小管损伤有关[24]。在一项包含88例系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者的病例对照研究中，尿α-1抗胰凝乳蛋白酶，视黄醇结合蛋白和触珠蛋白被鉴定为LN活动的潜在生物标志物[25]。

5 展望

综上所述，目前初步研究已证实了尿蛋白质组学以及CKD273分类器在CKD早期诊断及预后方面的巨大潜力，考虑到尿液标本收集的非侵入性和尿蛋白质组的相对稳定性，CKD273目前正在进行大规模的临床试验以评估其诊断效能，并通过了美国食品和药物管理局（FDA）的认可[26]，但需要更多大样本多中心临床试验来证明其临床效能。我们下一步努力的方向是在生物标志物组中单独或组合地研究所提出的肽，并且可能添加目前未发现的新肽，以找到标记CKD诊断、预后潜力最大价值的组合。另外，想要尿蛋白组学进一步运用于临床，将精准的科研，实验室和软件开发实践于CKD273的质量控制和验证是必不可少的。

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（收稿日期：2019-12-24） （本文編辑：周亚杰）