1，25-(OH)2D3对大鼠肾纤维化的影响及其机制

王佳祺 张令歌 孙明姝 李勋亮 孙建平

[摘要] 目的 探讨1，25-（OH）2D3是否能通过调节肾脏microRNA-21的表达延缓肾纤维化的进展。方法将SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）、单侧（左）输尿管结扎组（UUO组）和1，25-（OH）2D3干预组（干预组），每组12只。UUO组和干预组采用单侧（左）输尿管结扎法建立梗阻性肾纤维化大鼠模型，Sham组仅游离左侧输尿管而不结扎。干预组给予0.06 μg/（kg·d）的1，25-（OH）2D3（溶于2 mL花生油）灌胃，持续28 d;Sham组和UUO组均给予等体积花生油灌胃。分别于灌胃14、28 d时，每組取6只大鼠，测定其血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、钙（Ca）、磷（P）等水平;取左侧肾脏相同部位组织制作病理组织切片，行苏木精-伊红染色和Masson染色，在光镜下观察肾小管间质损伤及纤维化情况;采用RT-PCR法检测各组肾组织microRNA-21的表达水平。结果 UUO组的肾纤维化面积大于干预组和Sham组。UUO组和干预组大鼠各时间点Scr、BUN以及microRNA-21表达水平均高于Sham组，但干预组较UUO组降低，差异均有显著性（F=5.82～280.71，P<0.05）。结论 1，25-（OH）2D3可能通过下调microRNA-21表达，在一定程度上抑制肾纤维化并保护肾功能。

[关键词] 骨化三醇;微RNAs;肾;纤维化;大鼠

[中图分类号] R692;R977.24  [文献标志码] A  [文章编号] 2096-5532（2020）06-0640-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.149 [开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200714.1256.003.html;

[ABSTRACT] Objective To investigate the possibility of 1，25-（OH）2D3 delaying the progression of renal fibrosis by regulating the expression of microRNA-21 in the renal tissues.  Methods A total of 36 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group （sham group）， left unilateral ureteral obstruction group （UUO group）， and 1，25-（OH）2D3 treatment group （treatment group）， with 12 rats in each group. The rats in the UUO group and treatment group underwent left unilateral ureteral obstruction to establish a rat model of obstructive renal fibrosis， while the rats in the sham group had their left ureter only dissociated from the kidney but not ligated. The rats in the treatment group were intragastrically administered 1，25-（OH）2D3 （dissolved in 2 mL peanut oil） at a dose of 0.06 μg/（kg·d） for 28 consecutive days; the rats in the sham group and UUO group were given the same volume of peanut oil by intragastric administration. On days 14 and 28 of the intragastric administration， six rats of each group were randomly selected for analysis. The levels of serum creatinine （SCr）， blood urea nitrogen （BUN）， serum calcium （Ca）， serum phosphorus （P） were measured; the renal tissues from the same part of the left kidney were collected to make histopathological sections for hematoxylin-eosin staining and Masson staining， and the pathological changes of renal tubulointerstitial injury and fibrosis were observed under an optical microscope; RT-PCR was employed to measure the expression of microRNA-21 in the renal tissues of the rats in each group.  Results The renal tubulointerstitial fibrosis area was significantly larger in the UUO group than in the sham group and treatment group. The UUO group and treatment group had significantly higher SCr and BUN as well as expression of microRNA-21 than the sham group at all time points， but the treatment group had significantly lower indicators listed above compared with the UUO group （F=5.82-280.71，P<0.05）.  Conclusion 1，25-（OH）2D3 can inhibit the progression of renal fibrosis and protect renal function to a certain extent， possibly by down-regulating the expression of micro-RNA-21 in the renal tissues.

2.2 血清指标的比较

2.2.1 Scr 时间主效应显著（F=20.339，P<0.05），组别主效应显著（F=60.566，P<0.05），组别与时间无交互效应（F=2.023，P>0.05）。干预组、UUO组大鼠各时间点的Scr水平均高于Sham组，干预组低于UUO组，差异具有统计学意义（t=3.242～8.695，P<0.05）。组内比较，Sham组术后14 d与28 d比较差异无显著性，干预组和UUO组术后28 d Scr水平高于术后14 d，差异具有统计学意义（t=3.667、3.156，P<0.05）。见表2。

2.2.2 BUN 时间主效应显著（F=8.585，P<0.05），组别主效应显著（F=280.706，P<0.05），组别与时间交互效应显著（F=5.822，P<0.05）。干预组、UUO组大鼠各时间点BUN水平均高于Sham组，干预组低于UUO组，差异有统计学意义（t=6.188～17.980，P<0.05）。组内比较，Sham组和UUO组术后14 d与28 d比较差异无统计学意义，干预组术后28 d高于术后14 d，差异具有统计学意义（t=4.087，P<0.05）。见表2。

2.2.3 Ca和P 各组大鼠各时间点Ca、P水平比较差异均无显著性（P>0.05）。见表2。

2.3 病理学改变

2.3.1 HE染色 Sham组大鼠肾组织未见明显病理改变。术后14 d，UUO组可见肾小管上皮细胞弥漫性肿胀、变性、萎缩，管腔扩张，肾小管结构紊乱、变形，多数肾小管基底膜丧失;肾间质增宽，间质内炎症细胞浸润;肾小球病理改变不明显。术后28 d，肾间质明显增宽，大量炎症细胞浸润，纤维化程度加深。相对于UUO组，干预组同一时间点肾间质病变程度较轻，肾小管基底膜多呈不规则改变，部分视野肾间质、肾小管损伤不明显，肾间质纤维化相对面积明显减少。各组均未见钙化点、钙化灶。

2.3.2 Masson染色 Sham组大鼠肾间质未见明显阳性染色。随梗阻时间延长，UUO组大鼠肾间质中胶原纤维阳性染色面积增大，术后14 d可见多数肾小管管腔扩张，肾间质增宽，纤维组织增生，炎症细胞浸润;术后28 d上述情况加剧。与UUO组相比，干预组在相同时间点的胶原沉积程度和肾小管管腔扩张程度显著减轻。见图1。

2.4 各组大鼠肾组织microRNA-21表达的比较

时间主效应显著（F=25.170，P<0.05），组别主效应显著（F=34.051，P<0.05），组别与时间交互效应显著（F=7.088，P<0.05）。干预组、UUO组大鼠各时间点microRNA-21表达均高于Sham组，干预组较UUO组降低，差异具有统计学意义（t=3.093～8.330，P<0.05）。组内比较，Sham组和干预组術后14 d与28 d比较差异无显著意义，UUO组术后14 d的microRNA-21表达水平低于术后28 d（1.00±0.00 vs 2.16±0.60），差异具有统计学意义（t=2.801，P<0.05）。见表3。

2.5 microRNA-21表达与肾间质纤维化的关系

参考崔炯等[17]的方法对Masson染色肾间质纤维化程度进行评分，并与microRNA-21的表达进行相关性分析，结果显示，microRNA-21表达与肾间质纤维化程度呈显著正相关（r=0.881，P<0.05）。

3 讨  论

肾纤维化以成纤维细胞和细胞外基质蛋白的异常沉积为特征，伴随肾小球硬化、肾小管萎缩、肾间质炎症、实质细胞丢失，肾功能逐渐丧失，其过程复杂，如何逆转或延缓肾纤维化进展仍是目前研究的重点[18]。1，25-（OH）2D3与维生素D受体（VDR）特异性结合发挥生物学效应。VDR分为膜VDR（mVDR）和核VDR（nVDR）两大类。mVDR主要参与控制矿物质的动态平衡;nVDR参与基因的表达，调控细胞的增殖、分化，在抗炎、抗癌、抗氧化、抗纤维化以及免疫调节中起重要作用[19-21]。目前，活性维生素D用于CKD与透析病人中以纠正钙磷代谢紊乱已达成专家共识[22]。

随着研究的深入，microRNAs作为生物学靶点治疗各种疾病已受到学界的广泛关注。既往研究结果表明，肾纤维化与microRNAs的表达有着密切的关系[12]。TGF-β是肾纤维化的关键因子，既可由microRNA-21进行调节，又可通过Smad3信号传导诱导microRNA-21表达，microRNA-21与TGF-β/Smad3信号途径之间存在正反馈调节[23]。UUO（单侧输尿管梗阻）模型是以加速的方式模仿人类慢性阻塞性肾病[24]。在本研究中，UUO组大鼠Scr水平升高，肾小管扩张明显，多数肾小管基底膜完全丧失，间质显著增宽，可见到大量单核细胞浸润、纤维组织增生，肾间质损伤及纤维化程度增高，提示UUO模型建立成功。随着UUO模型大鼠肾纤维化的进展，microRNA-21的表达水平增加且与肾纤维化程度呈显著正相关，表明microRNA-21参与肾纤维化的过程并随肾纤维化的进展其表达水平增高。与UUO组相比，干预组大鼠Scr水平降低，且HE染色、Masson染色结果也显示，干预组大鼠肾小管间质损伤及纤维化程度明显改善，表明1，25-（OH）2D3在一定程度上具有延缓UUO模型大鼠肾小管间质纤维化、保护肾功能的作用，这与既往研究结果一致[12，16，25]。随着时间的进展，Sham组大鼠肾脏组织形态未见明显变化，而UUO组和干预组大鼠肾脏组织的纤维化面积逐渐增大，提示1，25-（OH）2D3虽然可以延缓UUO模型大鼠肾纤维化进展，但不能逆转肾纤维化。各组血Ca、P水平比较差异无统计学意义，说明1，25-（OH）2D3的抗纤维化作用不依赖于钙磷调节途径。据文献报道，1，25-（OH）2D3与其受体结合可降低Smad3的转录活性，抑制TGF-β的表达，从而抑制肾纤维化[16，25]。因此，1，25-（OH）2D3与microRNA-21存在共同的调控肾纤维化的途径，即TGF-β/Smad3。本文研究结果显示，Sham组大鼠肾组织microRNA-21的表达水平低于UUO组和干预组，而干预组大鼠肾组织microRNA-21的表达低于UUO组，差异有统计学意义，说明1，25-（OH）2D3可能下调了大鼠肾组织中microRNA-21的表达水平。

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（本文编辑 马伟平）