葛根淀粉生产水中葛根素的富集纯化工艺优化

徐梦玮 肖力 李漪锦 董新荣 刘德明 朱池明

摘要：研究了大孔吸附树脂富集纯化葛根淀粉生产排放水中葛根素的方法，并考察了15种型号的树脂对葛根总异黄酮的动态吸附容量及乙醇的洗脱效果。结果表明，HPD-300树脂对葛根总异黄酮的动态吸附容量可达到39.41 mg/mL，吸附后的树脂以70%乙醇1.0 BV/h流速进行梯度洗脱的洗脱率可达到91.42%。从3 L排放水中可回收总异黄酮样品4.7 g，总异黄酮含量（UV比色法）可达到61.67%，葛根素含量（HPLC法）可达31.80%。总异黄酮粗品经5%盐酸水解及重结晶，得到了96.37%高纯度的葛根素样品，相对总异黄酮粗品的回收率为15.91%。以上方法为从葛根淀粉生产排放水中富集纯化葛根素的最佳优化工艺条件。

关键词：葛根;葛根素;分离纯化;大孔吸附树脂;总异黄酮

中图分类号：R282         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）18-0107-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.021 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of enrichment and purification process of

puerarin in the production of pueraria starch

XU Meng-wei1a， XIAO Li1a， LI Yi-jin1a，DONG Xin-rong1a， LIU De-ming1b， ZHU Chi-ming2

（1a. College of Science， 1b. Center of Analytic Service， Hunan Agricultural University， Changsha  410128，China;

2. Zhangjiangjie Pure Natural Agricultural Products Development Co. Ltd.， Zhangjiajie  427200，Hunan，China）

Abstract： The method of puerarin enrichment and purification from water discharged by producing pueraria starch using macroporous resin as adsorption material was studied. The saturated capacity of dynamic adsorption （SCD） and elution rate （ER） of fifteen type of resin for total isoflavones of pueraria was investigated. The results indicated that the SCD for total isoflavones of pueraria was 39.41 mg/mL resin and the ER of resin was 91.42% eluted by 70% ethanol aqueous at 1.0 BV/h flow rate. And 4.7 g of crude isoflavones with the content of total isoflavones of 61.67% （UV spectrophotometry） and the content of puerarin of 31.80% （HPLC） could be recovered from    3 L discharge water. A high purity sample which contained 96.37% puerarin was obtained by 5% HCl hydrolysis and recrystallization， and recovery of puerarin was 15.91%. This was the best process optimization for puerarin enrichment and purification from water extracted pueraria starch.

Key words： pueraria; puerarin; enrichment and purification; macroporous adsorbent resin; total isoflavones

葛根是国家卫生部批准的药食两用植物。葛根药用始载于《神农本草经》[1]，中国药典亦有收录 [2]。葛根的主要活性成分为异黄酮类化合物 [3，4]。目前，从葛根中分离鉴定的异黄酮类化合物多达几十种，主要有葛根素、大豆素、大豆苷、染料木素、芒柄花素等。葛根异黄酮具有植物雌激素、扩张冠脉血管等作用，以及抗肿瘤、降血糖、降血脂及抗氧化等活性[5-10]。葛根素则为葛根中特有的一种异黄酮，在临床上已被广泛应用于心脑血管系统疾病、糖尿病、眼底疾病及肿瘤的治疗[11-13]。

葛根淀粉在中国民间食用的历史悠久。近年来，葛根淀粉生产开始出现规模化的加工企业，但一般采用传统的加工工艺[14，15]。在淀粉生产过程中存在用水量较大、葛根异黄酮随水排放流失导致环境污染的问题。本研究旨在建立葛根淀粉生产排放水中葛根素的富集纯化工艺条件，为葛根资源的综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 葛根素（批号：110752-201615）购自中国食品药品检定研究院。葛根淀粉生产排放水由张家界越天然农产品开发有限公司提供。大孔树脂 HPD-300、HPD -400、HPD-100、HPD-700、HPD-722、HPD-826、HPD-750、HPD-500、HPD-450，购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司;D101、AB-8购自天津市光复精细化工研究所;LSA-40、ADS-7、LSA-21、DM-301購自郑州勤实科技有限公司。乙醇为食用级，甲醇为分析纯，水为去离子水。

1.1.2 仪器与设备 UV-2450紫外可见分光光度计、岛津LC-20AT高效液相色谱仪、ATY124万分之一电子天平购自日本岛津公司;TP-520A电子天平购自湘仪天平仪器设备有限公司;TG16-WS高速离心机购自长沙湘智离心机仪器有限公司;KQ-300DE型数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司;旋转蒸发器RE-52C购自巩义市予华仪器有限责任公司;SHA-C恒温振荡器购自常州智博瑞仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分析方法

1）总异黄酮含量测定。葛根素标准曲线的绘制：准确称取 6.0 mg葛根素标样于100 mL烧杯中，加适量甲醇溶解，将其定量转移至25 mL容量瓶中，定容，摇匀。分别移取 0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mL储备液于10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀。在250 nm下测定吸光度，以吸光度对葛根素浓度绘制标准曲线。样品分析：准确称取10 mg分离样品于100 mL烧杯中，加适量甲醇溶解，定量转移至25 mL容量瓶中，定容摇匀。在波长250 nm下测定吸光度，计算测定溶液中总异黄酮的浓度C1，按公式（1）计算样品中总异黄酮的含量。

[总异黄酮含量=C1×f×V×10-6m0×100%] （1）

式中，C1为待测液中总异黄酮的浓度（mg/L）;   f为稀释倍数;V为待测液体积（mL）;m0为鲜葛根的质量（g）。

2）葛根素含量测定。HPLC条件：InertSustain-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相A为水;流动相B为甲醇。梯度洗脱条件：0～25.00 min，30%～70%B;25.00～25.10 min，70%～100% B;25.10～27.00 min，100% B;27.00～27.10 min，30% B;27.10～34.00 min，30% B。流速为0.80 mL/min。柱温35 ℃。检测波长250 nm。进样量10 μL。

标准曲线：配制葛根素浓度为1.747～57.576 mg/L的系列标准品溶液，按色谱条件测定并绘制标准曲线。

样品测定：准确称取10 mg样品于25 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀。按上述色谱条件测定，以标准曲线计算样品溶液中葛根素的浓度，并按公式（2）计算葛根素含量。

[葛根素含量=C2×f×V×10-6m0×100%] （2）

式中，C2为待测液中葛根素的浓度（mg/L）;f为稀释倍数;V为待测液体积（mL）;m0样品质量（g）。

1.2.2 葛根淀粉生产排放水的前处理 将葛根淀粉生产排放水静置48 h，取上层清液于9 000 r/min下离心5 min，收集离心液，备用。

1.2.3 大孔树脂的静态筛选 量取5 mL经预处理的大孔树脂于250 mL的锥形瓶中，加入上述预处理的水溶液100 mL，于25 ℃水浴的振摇器中以100 r/min速度振摇3 h，然后室温静置吸附18 h。取适量上清液测定吸光度。过滤，用适量去离子水清洗树脂。然后将吸附葛根总异黄酮的树脂置于锥形瓶中，加入95%的乙醇45 mL，按上述方法于恒温振摇器中振摇1 h。过滤，收集滤液，定容至50 mL，测定吸光度并计算总异黄酮的浓度。计算树脂的饱和吸附量及洗脱率。

对饱和吸附容量较大、洗脱率较高的6种树脂重复筛选。洗脱时采用30%、50%、70%、95%的乙醇溶液进行梯度洗脱，其余方法同上。

[Qe=（C0-Ce）×Vm×100%]      （3）

式中，Qe为饱和吸附容量（mg/g）;C0、Ce为吸附前、平衡后溶液浓度（mg/mL）;V为溶液体积（mL）;m为树脂的质量（g）。

[洗脱率=Cx×Vxme×100%]      （4）

式中，Cx为洗脱液浓度（mg/mL）;Vx为洗脱液体积（mL），me为树脂饱和吸附量（mg）。

1.2.4 大孔树脂的动态吸附与洗脱

1）大孔树脂的动态吸附筛选。取30 mL预处理好的HPD-300、HPD-100、D101，分别装入直径2.0 cm，柱高10.0 cm的色谱柱中。然后以总异黄酮含量为0.967 5 mg/mL的预处理液连续上样至饱和吸附（流出液的吸光度约等于上样液的吸光度后继续上样约10%体积的上样液）。然后先以2 BV的纯水洗涤树脂柱，再用6 BV的70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。测定洗脱液吸光度，按式（3）、（4）分别计算树脂的动态饱和吸附容量及动态洗脱率。

2）大孔树脂动态吸附与洗脱条件。取30 mL预处理的HPD-300大孔树脂，装入直径2.0 cm，柱高10.0 cm的色谱柱中。考察上样液中总异黄酮浓度、上样流速对树脂吸附的影响。间隔收集流出液，测定吸光度，绘制总异黄酮在树脂上的动态吸附曲线。

吸附总异黄酮的树脂柱先以2 BV的去离子水洗涤，再依次用6 BV的30%、50%、70%乙醇进行梯度洗脱。考察乙醇体积分数对洗脱效果的影响。测定洗脱液吸光度，按式（4）计算树脂乙醇梯度的洗脱率，绘制总异黄酮的动态洗脱曲线。进一步用    6 BV 70%乙醇以不同的流速洗脱吸附在树脂上的总异黄酮计算洗脱率，考察洗脱流速对树脂上总异黄酮洗脱率的影响。

1.2.5 葛根素的纯化 称取2 g的葛根总异黄酮粗品于圆底烧瓶中，加入5% HCl溶液80 mL，加热回流4 h。趁热过滤，收集滤液。待滤液冷却后，用NaCO3调节pH到4～5。以等体积的乙酸乙酯分3次萃取，收集水相。用旋转蒸发仪浓缩后至原体积的1/10左右，冷却过夜;过滤，收集固体。将固体用CH3COOH-H2O（1∶9，V/V）重結晶，过滤，得到高纯度的葛根素样品。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的静态筛选

对15种大孔树脂进行初步筛选，在此基础上进一步对HPD-300、HPD-100、HPD-500、D101、LSA-40、ADS-8 6种树脂的吸附与洗脱效果进行比较，并对吸附了葛根总异黄酮的树脂依次以30%、50%、70%、95%的乙醇溶液进行梯度洗脱，其静态吸附和解吸附的结果如表1所示。

由表1结果可知，葛根总异黄酮在2个非极性的HPD大孔树脂上的静态吸附效果均较好。从解吸附的结果上来看，吸附在树脂上的葛根总异黄酮用30%、50%乙醇洗脱，解析率在76.65%～86.78%，而且HPD系列的非极性树脂及D101的洗脱效果均很好。因此，进一步选取HPD-300、HPD-100、D101进行动态吸附与洗脱的效果比较。

2.2 大孔树脂的动态吸附

2.2.1 动态筛选 在静态筛选的基础上，对3种大孔树脂（HPD-300、HPD-100、D101）进行动态饱和吸附与洗脱的筛选。它们的动态饱和吸附量及70%乙醇动态洗脱的结果如表2所示。由表2可知，HPD-300树脂对葛根总异黄酮的饱和吸附容量较大。从解吸附效果来看，70%乙醇对吸附在3种树脂上的总异黄酮的洗脱率接近;从含量分析来看，HPD-100树脂解吸所得样品中葛根总异黄酮的含量较HPD-300稍低。因此，选用HPD-300进行下一步试验。

2.2.2 HPD-300树脂的饱和吸附曲线 在30 mL树脂（柱高10.0 cm）柱上，以总异黄酮浓度为0.80 mg/mL水溶液1.0、2.0 BV/h的流速上样，HPD-300树脂的动态吸附曲线如图1所示。在大孔树脂的动态吸附研究中，一般认为流出液的浓度为上样液浓度的1/10时对应的流出液体积为该浓度下的泄露曲线的泄漏点[16]。树脂HPD-300在2个流速条件下的泄露点时所对应的体积分别为1 050 mL（1.0 BV/h）和500 mL（2.0 BV/h），此时树脂的动态吸附量分别为每毫升树脂28.00、13.33 mg。此后，树脂对总异黄酮的吸附速度减小，流出液中总异黄酮的量以较快的速度增加。当流出液中总异黄酮的浓度接近上样液浓度时停止上样，此时树脂在2个流速下的吸附量分别为每毫升树脂37.15、35.34 mg。

2.3 HPD-300树脂的动态洗脱

2.3.1 乙醇体积分数对总异黄酮洗脱的影响 将动态吸附达饱和的树脂依次用6 BV的 30%、50%、70%乙醇，以1.0 BV/h流速进行梯度洗脱，结果如图2所示。由图2可知，30%的乙醇对吸附在HPD-300树脂上的葛根总异黄酮的洗脱具有很好的效果。实际上，30%、50%及70%乙醇梯度洗脱时所得溶液中总异黄酮的总量分别为 795.9、227.0、29.4 mg，分别占洗脱总量的75.64%、21.57%、2.79%。根据总异黄酮在树脂上的吸附总量计算，30%、50%及70%乙醇的洗脱率分别为70.42%、18.37%、2.63%。结果表明，吸附在树脂上的总异黄酮可由50%乙醇洗脱下来，洗脱率可达到88.79%。

2.3.2 洗脱流速对树脂上总异黄酮洗脱率的影响 进一步用6 BV 70%乙醇以不同的流速洗脱吸附在树脂上的总异黄酮，结果如图3所示。由图3可知，洗脱流速较慢时，用70%乙醇洗脱使用量较少时可达到较好的洗脱效果。以6 BV的70%乙醇基本可将总异黄酮洗脱下来。计算结果表明，树脂分别以1.0、1.5、2.0 BV/h流速洗脱时，总异黄酮的洗脱率分别可达到91.42%、82.44%、81.06%。将洗脱液减压回收乙醇，可得到葛根总异黄酮样品。

2.4 分离样品的分析

2.4.1 总异黄酮 用紫外可见分光光度法在250 nm处测定葛根素标准溶液的吸光度，葛根素的浓度在2.4～19.2 mg/L范围时其浓度与吸光度具有线性关系，线性方程为Y=0.016 2+59.048 96X，（R = 0.999 8，n = 5）。

将HPD-300树脂吸附的洗脱液回收乙醇至干燥，可得到葛根总异黄酮样品。对样品中总异黄酮用比色法进行分析。用6 BV 70%乙醇以1.0、1.5、2.0 BV/h流速洗脱吸附树脂时，从HPD-300树脂富集所得样品的总异黄酮含量分别可达到61.67%、60.11%、56.51%。

2.4.2 葛根素 按“1.2.1”中的色谱条件，得到色谱图如图4A所示，葛根素浓度在1.747～57.576 mg/L范围内，浓度与积分面积具有良好线性关系，y =    29 348.4x - 841.565，R2 = 0.999 6（n=7）。

进一步对大孔树脂分离所得总异黄酮样品及酸水解纯化的葛根素样品进行HPLC分析，分析了葛根素的含量，HPLC图谱如图4所示。

按标准曲线计算，葛根淀粉生产排放水以大孔树脂吸附富集，再以70%乙醇1 BV/h流速洗脱所得到总异黄酮样品中葛根素的含量为31.80%。总异黄酮样品经酸水解、重结晶等步骤纯化后得到的样品中葛根素纯度达到了96.37%。

3 小结与讨论

本研究以葛根淀粉生产企业的排放水为原料，以HPD-300大孔树脂吸附总异黄酮，以6 BV的70%乙醇洗脱，可实现排放水中总异黄酮的回收。洗脱液回收乙醇、減压干燥后即可得到固体总异黄酮样品（3 L排放水中可回收异黄酮样品4.7 g）。以1.0 BV流速的70%乙醇洗脱时所得样品中总异黄酮含量（UV比色法）可达到61.67%，葛根素含量（HPLC法）可达到31.80%。进一步经5%盐酸水解及重结晶，得到了纯度为96.37%的葛根素样品（葛根素样品相对总异黄酮粗品的收率为15.91%）。

葛根为传统的药食两用植物，其块状根中淀粉含量较高，对生长的环境要求不高，耐贫瘠、耐干旱，适合边远山区种植。近年来，很多地方的葛根种植与生产加工已经成为贫困山区农民脱贫致富的引擎。但是大部分葛根产区小型淀粉加工厂较多，在技术上仅提取和利用了葛根淀粉。这不仅造成了葛根总异黄酮的资源浪费，而且含总异黄酮的水直接排放会对环境造成较大的影响。葛根药用价值的主要活性成分为葛根素等异黄酮类化合物，葛根素在临床上用于治疗心脑血管等疾病。从葛根淀粉加工厂排放水中富集回收葛根总异黄酮，并进一步经盐酸水解及重结晶等步骤纯化得到96.37%高纯度的葛根素，这一优化后的工艺不仅综合利用了资源，从生产源头上防止了环境污染，而且还可以为葛根生产企业增加经济收益。

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