山西老陈醋源植物乳杆菌CP234对大鼠非酒精性脂肪肝的保护作用及机制

许 女 王超宇 李雅茹 张 浩 王如福

（山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷030801）

如今，除糖尿病、高脂血症及肥胖等代谢疾病的流行外，非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD） 也成为世界医学和公共健康问题。目前，治疗NAFLD 常见的药物主要有维生素E、己酮可可碱、二甲双胍、匹格列酮、胆烷酸、他汀类等，然而，疗效显著的药物仍然缺乏，并且存在的副作用尚不清楚[1]。肠道与肝脏在结构、功能上存在着多种密切关系，越来越多的证据表明肠道菌群在NAFLD 的产生和病变中有着重要的影响。Fouts D E 等[2]，Le R T 等[3]和Miele L 等[4]研究发现，在NAFLD 患者以及动物模型中，存在其肠黏膜通透性增加，细菌易位，小肠细菌过度生长，菌群平衡遭到破坏和内毒素升高等情况。相反，菌群失调则会造成细菌和细菌内毒素向门脉循环转移并使炎症因子的释放，影响肠道黏膜的屏障功能，造成肝功能损伤。近年来兴起采用益生菌、益生元、中草药活性提取物及健康肠道菌群抑制等调节肠道菌来治疗非酒精性脂肪肝。

益生菌制剂可以调整肠道微生态以防治NAFLD。近年来一些研究数据支持了这一结论，其中涉及的菌种包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌及联合益生元等。包含的机理主要有：黏附，调节肠道菌群，保证肠道屏障的完整性，降低内毒素、脂多糖等的产生及转移，缓解代谢损伤；有效清除非酒精性脂肪肝所产生的大量活性氧，避免氧化应激所引起的脂质过氧化导致的肝脏的 “二次打击”；调节胆固醇及脂类代谢，抑制并降低胆固醇、甘油三酯等在肝脏中的沉积，改善短链脂肪酸及胆汁酸代谢，进而改善肝纤维化；调节免疫，降低肝脏中炎症因子的分泌，降低炎症反应损伤[5]。

本文主要研究山西老陈醋源植物乳杆菌CP234 对大鼠非酒精性脂肪肝的保护作用及机制，为其进一步开发、应用奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CP234，山西农业大学食品科学与工程学院，生物工程实验室保存；总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）测定试剂盒，北京中生北控公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒，谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；总RNA 提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa RR036A 反转录试剂盒、TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II，宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 主要仪器、设备

CFX96 荧光定量PCR 仪，美国BioRad 公司；Thermo 酶标仪，芬兰Thermo Electron 公司；6890N 气相色谱仪、FID 检测器、CP-Sil 88 色谱柱，美国Agilent Technologies 公司；UItimate 3000液相色谱仪，德国赛默飞公司。

1.3 受试菌液的制备

将试验的植物乳杆菌CP234 菌株按照3%的接种量接于MRS 液体培养基中，37 ℃培养24 h后，以8 000 r/min 离心10 min，弃上清液，加无菌生理盐水洗涤两次，之后调OD 值，使菌液含量为1010CFU/mL。

1.4 大鼠实验设计

SD 雄性大鼠，适应实验环境1 周后，将大鼠随机分为正常对照组、高脂模型组和植物乳杆菌CP234 组，每组10 只。正常对照组给予正常的饲料，高脂模型组和植物乳杆菌CP234 组给予高脂的饲料，按照10 mL/kg 体重给植物乳杆菌CP234组灌胃受试菌液，高脂模型组与正常对照组给予等量生理盐水，自由摄取食物和水，动物房温度（22±2）℃，湿度（56±5）%，饲养5 周。

基础饲料：蛋白质32%，脂肪5%，纤维素2%，Ca 1.8%，P 1.2%，无氮提取物58%，购于北京康桥饲料公司。

高脂饲料：基础饲料83.5%，胆固醇1%，猪油10%，牛胆盐0.3%，丙基硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%。

1.5 指标测定

1.5.1 血清ALT，AST 活性和肝脏氧化应激指标测定 每周末对大鼠眼眶静脉采血1 mL，离心（3 000 r/min，15 min） 取血清，测定大鼠血清HDL-C、LDL-C、TG 和TC 的含量。5 周后，大鼠经水合氯醛麻醉，心脏刺穿采血处死，按照试剂盒说明书测定大鼠血清ALT、AST 及肝脏SOD、GSHPx 和MDA 氧化应激指标。

1.5.2 肝脏脂肪酸测定 将大鼠肝脏放入液氮中充分研磨成粉末。采用氯仿-甲醇萃取法提取粗脂肪，加入C21：0内标，经氢氧化钾-甲醇溶液甲酯化，采用气相色谱法测定肝脏脂肪酸组成。

色谱条件：选用CP-Sil 88 型毛细管色谱柱和FID 检测器，进样量1 μL，载气为氢气，进样口和检测器的温度为250 ℃，分流比10∶1，氢气流量26 mL/min，空气流量300 mL/min。升温程序：初温60 ℃，保持5 min，以11.5 ℃/min 升至170 ℃，保持25 min；以5 ℃/min 的速率升至200 ℃，保持5 min；以2 ℃/min 升温至215 ℃，保持20 min。

1.5.3 肝脏脂代谢相关基因表达 提取大鼠肝脏总RNA，反转录得cDNA。利用CFX96 荧光定量PCR 仪测定肝脏脂代谢相关基因的表达。

表1 实时定量PCR 引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.5.4 粪便菌群、pH 值、水分和有机酸测定

1）粪便菌群的测定 每周末无菌收集新鲜粪便测定其活菌数。乳杆菌用乳杆菌选择性培养基，37 ℃好氧培养48 h；双歧杆菌用BBL 琼脂培养基，37 ℃厌氧培养48 h；肠杆菌用伊红美蓝琼脂，37 ℃好氧培养48 h 后计数。

2）粪便pH 值和水分含量测定 每周末收集大鼠新鲜粪便，测定其pH 值和水分含量。

粪便pH 值的测定方法：取2 g 新鲜粪便溶于20 mL 水中，用pH 计测定其pH 值。

粪便含水量的测定方法：将新鲜粪便置于80℃的烘箱中，烘干至恒重。

粪便含水量=（烘干前的粪便总质量－烘干后的粪便总质量）/烘干前的粪便总质量×100%

3）粪便有机酸含量的测定 每周末收集大鼠新鲜粪便，测定其有机酸含量。取0.5 g 新鲜粪便，加入1 mL 蒸馏水混匀，用去离子水浸泡3 h，抽滤，12 000 r/min 离心10 min，取其上清液于0.22 μm 微孔的滤膜过滤，进样检测。

色谱条件：液相色谱仪UItimate 3000；色谱柱选择Agilent ZORBAX-C18 4.6 mm×150 mm，5 μm；流动相为pH 2.7 的20 mmol/L NaH2PO4；进样量20 μL；流动速度0.8 mL/min；紫外检测波长210 nm；柱温30 ℃。

2 结果与讨论

2.1 植物乳杆菌CP234 对大鼠血清TC，HDLC，LDL-C，TG 的影响

植物乳杆菌CP234 对饲喂了高脂饲料大鼠血清的影响见表2。在饲养结束时，相比于对照组，模型组大鼠的TC，LDL-C 和HDL-C 的含量都显著升高，并且随着饲喂时间的延长而呈现梯度升高的趋势。TG 的浓度在前两周基本没有变化，从第3 周开始显著升高。与模型组相比，灌喂植物乳杆菌CP234 菌液的大鼠TC 浓度显著降低，分别降低了16.20%（灌胃2 周），1.92%（灌胃3 周），26.67%（灌胃4 周），28.84%（灌胃5 周）。另外，LDL-C 浓度也显著降低（P<0.05），在第4 周和第5周内降低最多，比模型组分别低了24.00%和17.85%。TG 的浓度，在前3 周内，两组之间没有显著的差异，从第4 周开始，灌喂植物乳杆菌CP234的大鼠TG 浓度显著降低，在试验结束时降低了22.01%。然而，HDL-C 的浓度在两组之间并没有显著的差异，都显著高于对照组。HDL-C 是血浆中胆固醇运回肝脏的主要方式之一，血清中HDL-C 含量与胆固醇运回肝脏中的能力成正比，含量越高能力越强，机体心血管就越健康。Ibrahim A 等[6]和St-Onge M P 等[7]也得到相似的结果。然而，Chiu CH 等[8]发现乳酸菌可以降低仓鼠血清中的HDL-C 的浓度，Keim N L 等[9]和Rossouw J E 等[10]也在人体临床试验中，证实了相似的结论。Hashimoto H 等[11]称干酪乳杆菌TMC 0409 使血清中HDL-C 的浓度有所提高。乳酸菌对血清HDL-C 浓度的影响，至今仍没有定论，机理尚不明确。

表2 植物乳杆菌CP234 对喂养高脂饲料大鼠血清TC，HDL-C，LDL-C 和TG 的影响Table 2 Effects of Lactobacillus plantarum CP234 on serum TC，HDL-C，LDL-C and TG contents of rats fed on high fat diet

2.2 植物乳杆菌CP234 对大鼠肝脏指数、脂肪指数和脂肪酸组成的影响

表3显示，与正常组相比，大鼠高脂饮食模型组的肝脏指数和脂肪指数明显升高。给予高脂饲料，同时灌喂植物乳杆菌CP234 菌液，能够有效缓减这一症状。表4结果显示，高脂模型组肝脏脂肪酸的水平显著高于正常对照组。植物乳杆菌CP234 能显著降低∑SFA（16.971 mg/g）、∑MUFA（22.711 mg/g）、∑PUFA（22.207 mg/g）和∑FA（61.889 mg/g）的含量，相比于模型组，分别降低了19.89%，22.73%，19.68%和20.89%。近年来众多研究发现，补充n-3，n-6 多不饱和脂肪酸（PUFA）如C22：6n-3（DHA），C20：5n-3（EPA）和花生四烯酸（ARA，n-6 LC-PUFA） 等可改善非酒精性脂肪肝代谢[12]。研究证明n-3PUFA 可以激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-AMPK）机制的表达，AMP-AMPK碱性磷酸化改善脂肪酸代谢，减少脂毒性；此外，n-3PUFA 能增强乳糜颗粒的代谢和清除能力，降低肝脏中分泌的极低密度的脂蛋白的数量，从而降低血清中的甘油三酯的含量。然而，也有报道[13]称过高的n-3，n-6PUFA 比较容易引发机体炎症，使得肝脏的功能受到损伤，也容易导致血清中的血脂代谢功能发生紊乱，LDL-C 与TG 的含量较高。表4结果显示，植物乳杆菌CP234 显著改变了高脂饲料大鼠的肝脏脂肪酸的组成。NAFLD（非酒精性脂肪肝）受环境、生活饮食干预、遗传等复杂综合因素影响，不同膳食脂肪酸构成对肝脏脂代谢有巨大影响，需从膳食脂肪酸调整及益生菌剂辅助补充等共同防治。

表3 植物乳杆菌CP234 对饲喂高脂饲料大鼠的肝脏指数和脂肪指数的影响Table 3 Effect of Lactobacillus plantarum CP234 on liver and adipose tissue indices of rats fed on high fat diet

表4 植物乳杆菌CP234 对饲喂高脂饲料大鼠的肝脏脂肪酸组成的影响Table 4 Effect of Lactobacillus plantarum CP234 on liver fatty acids composition of rats fed on high fat diet

（续表4）

2.3 植物乳杆菌CP234 对大鼠血清ALT，AST活性和肝脏氧化应激的影响

表5结果显示，相比于对照组，模型组大鼠血清中的ALT 和AST 酶活显著升高，说明饲喂高脂饲料的大鼠肝细胞的膜通透性增加，反映出肝细胞受到一定程度的损伤[14]，而灌胃植物乳杆菌CP234 的大鼠，与模型组相比，血清中的ALT 和AST 酶活显著降低，表明植物乳杆菌CP23 具有改善肝功能的作用。

很多文献表明肝脏损伤与氧化应激的关联机制，肝脏的脂肪病变产生活性氧，当机体内抗氧化系统，如抗氧化酶-SOD、GSH 等来不能及时清除这些氧自由基时，就会氧化应激反应，而脂质的过量沉积为脂质过氧化损伤提供了反应基质，生成的大量过氧化物-MDA 等聚集，进一步刺激了肝脏细胞产生大量炎症因子，如肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素等，可能会加重肝脏炎症的反应并导致肝细胞死亡、肝纤维化[15-16]。由表5可知，模型组与正常组相比，高脂模型组的SOD、GSH 水平显著降低，MDA 的含量显著升高。灌胃植物乳杆菌CP234 后，各项指标均有显著改善。

表5 植物乳杆菌CP234 对饲喂高脂饲料大鼠血清ALT、AST 活性及肝脏SOD、GSH 和MDA 的影响Table 5 Effect of Lactobacillus plantarum CP234 on serum ALT，AST and liver SOD，GSH and MDA in rats fed on high fat diet

2.4 植物乳杆菌CP234 对大鼠肝脏脂代谢相关基因表达的影响

NAFLD （非酒精性脂肪肝）主要是机体内脂质代谢稳态遭到破坏，其中以胆固醇代谢紊乱最为常见，大量难以代谢的胆固醇使脂质在肝脏中沉积，并进一步诱导肝细胞产生脂肪变性及炎症。而胆固醇代谢的稳态依赖于其合成、吸收和排泄途径。机体内大部分胆固醇转运和代谢，依赖于与LDLR 的结合，利用内吞作用使其进入细胞内，和细胞内的溶酶体结合，水解成游离胆固醇和脂酸，并能转化为类固醇激素等参与机体生理代谢[17]。外源性胆固醇可以抑制肝脏LDLR 的表达，使细胞不能发挥对胆固醇的内吞作用，从而使过多的胆固醇在肝脏沉积，引发脂肪变性[18]。图1结果显示：高脂饮食抑制了LDLR 的表达，而植物乳杆菌CP234 显著上调了LDLR 的表达。

另外，机体内胆固醇的主要代谢方式或途径为：在肝脏中转化为胆汁酸，并从肠道排出。CYP7A1 作为胆汁酸合成的限速酶，其对调节胆固醇转化为胆汁酸代谢有着重要影响。本研究结果显示：植物乳杆菌CP234 可以上调CYP7A1 的表达，从而加速机体对胆固醇的代谢，使其转化为胆汁酸并排出体外。

除了研究胆固醇代谢相关基因的表达情况外，本文还研究了植物乳杆菌CP234 对其它脂代谢相关基因表达情况的影响。结果表明，灌胃植物乳杆菌CP234 5 周后，相比于模型组，如PPAR-α和CPT1-α 与脂肪氧化相关的基因显著上调，而PPAR-γ、FAS 和ACC-1 等与脂肪合成相关基因表达显著下调，显示出植物乳杆菌CP234 对NAFLD 的改善作用。PPAR 调控大量细胞内外脂类代谢目的基因的表达，是多种降脂药物主要作用靶点之一[19]。需要指出的是SCD-1 也属于脂肪合成基因，其与模型组相比，表达变化却不显著。机体内脂质代谢是一个复杂过程，具有多因素、多环节、多靶点的特征，因此，植物乳杆菌CP234 改善NAFLD 的具体机制仍需更深层次的研究。

图1 植物乳杆菌CP234 对饲喂高脂饲料大鼠的肝脏脂肪代谢相关基因表达的影响Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum CP234 on liver mRNA levels in rats fed on high fat diet

2.5 植物乳杆菌CP234 对大鼠粪便菌群、pH值、水分和有机酸的影响

肠道菌群能通过“肠－肝轴”来参与非酒精性脂肪肝的发生、发展。肠道菌群的代谢产物（如脂多糖、肽聚糖、短链脂肪酸、炎症诱导物等）能通过门静脉运送到肝脏，肝脏可直接处理代谢产物，进而调节肠道功能。肝脏是重要的靶向器官，病菌可以通过病原体相关分子模式使其引发急性炎症反应。肝脏脂代谢紊乱可诱发肠道菌群失调，而肠道消化、吸收、分泌、免疫、菌群失调又可影响肝脏。

改善非酒精性脂肪肝的菌群失衡状态现已成为研究热点。此方向涉及益生乳酸菌的抑菌，黏附，产有机酸，调控肠道通透性，增强黏膜免疫，促进粪便脂质、胆固醇、胆酸排出，改善脂代谢除等特性。图2显示植物乳杆菌CP234 对高脂饲料大鼠粪便菌群的影响。整个饲养期间，3 组大鼠粪便中的大肠杆菌数量基本上没有发生太大变化，保持在107～108CFU/g。植物乳杆菌CP234 组的大鼠粪便内含有的乳杆菌和双歧杆菌的数量从第3 周开始显著上升，到第5 周末试验结束时，分别达到11.98lg（CFU/g）和10.87 lg（CFU/g），其中乳杆菌的数量比模型组提高了1.98 lg（CFU/g），比对照组提高了2.60 lg（CFU/g）；双歧杆菌的数量比模型组提高了1.75 lg（CFU/g），比对照组提高了2.75 lg（CFU/g）。赵庆卫等[21]的研究结果也表明，与正常人相比，非酒精性脂肪性肝病人肠道中拟杆菌的数量显著增加，乳酸杆菌、双歧杆菌数量显著下降。王文成等[22]研究表明高脂饮食可以减少革兰氏阳性菌（如乳杆菌属和双歧杆菌属）的含量，增加革兰氏阴性菌（如肠杆菌属和拟杆菌属） 的含量。肠道菌群的数量多（1014）、种类复杂（1 000 多个种），应采取DGGE、高通量测序等手段研究菌群与非酒精性脂肪肝的关联机制。

本文还测定了植物乳杆菌CP234 对饲喂高脂饲料大鼠的粪便pH 值、水分和有机酸含量的影响，结果如图3和表6所示。对照组和模型组大鼠的粪便pH 值差异不显著；相比于对照组和模型组，摄入植物乳杆菌CP234 大鼠的粪便pH 值有所降低，是因为乳酸菌都在肠道内利用底物产酸的缘故。粪便含水量被作为是反映肠道健康，预防便秘，促进通便的一个指标。相比于对照组和模型组，植物乳杆菌CP234 组大鼠粪便含水量显著提高。Yanping W 等[23]也发现，嗜酸乳杆菌可以提高大鼠粪便中的含水量，呈现出调节肠道菌、通便的益生功能。对照组大鼠粪便中有机酸的变化趋势不明显，模型组和植物乳杆菌CP234 组大鼠随着喂养时间的延长，粪便中醋酸和丙酸的含量都显示递增的趋势，而丁酸含量没有显著变化。试验结束时，摄入植物乳杆菌CP234 的大鼠粪便中醋酸和丙酸含量都显著提高，尤其是丙酸含量，比模型组提高了63.09%。Liong M T 等[24]报道丙酸含量升高，降低了胆固醇合成途径中关键限速酶3-羟基-3 甲基戊二酰CoA （HMG-CoA） 还原酶的活性，有降低血清胆固醇的作用。NAFLD 由于肝脏线粒体功能障碍，进而造成ATP 的生成障碍，而丙酸作为TCA 循环中丙酮酸代谢的中间体，直接影响ATP 的生成。另外，有报道称非酒精性脂肪肝引起的代谢紊乱涉及TCA 循环、乙醛和二羧酸代谢、丁酸代谢、酮体代谢、甘氨酸、丝氨酸代谢等几个主要代谢通路，因此有必要采用代谢组学方法对这些通路上的代谢物质如苹果酸、延胡索酸、柠檬酸、顺-乌头酸、乙酰乙酸、D-葡萄糖、D-核糖等进行测定，进一步揭示NAFLD 的病变机制，阐明益生菌对NAFLD 的预防、辅助治疗机制。

图2 植物乳杆菌CP234 对饲喂高脂饲料大鼠的粪便菌群数量的影响Fig.2 Effect of Lactobacillus plantarum CP234 on fecal flora from rats fed on high-cholesterol diet

图3 植物乳杆菌CP234 对饲喂高脂饲料大鼠的粪便pH 值和水分的影响Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarum CP234 on pH and water content of fecal from Rats fed on high-cholesterol diet

表6 植物乳杆菌CP234 对饲喂高脂饲料大鼠的粪便有机酸含量的影响Table 6 Effect of Lactobacillus plantarum CP234 on organic acids concentration of fecal from rats fed on high-cholesterol diet

3 结论

植物乳杆菌CP234 通过降低非酒精性脂肪肝大鼠血清中谷草转氨酶 （AST） 和谷丙转氨酶（ALT）的活性，提高肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的酶活性，改善肝脏的氧化应激能力，进而修复肝功能。相比于模型组，CP234 显著上调了胆固醇分解和脂肪酸氧化的相关基因，显著下调了脂肪合成相关基因，如PPAR-γ、FAS、和ACC-1 的表达。另外，CP234 还通过调节、改善肠道菌群、有机酸组成等肠道内环境，综合预防非酒精性脂肪肝疾病。本文研究结果为将其进一步开发益生菌制剂，通过调整肠道微生态预防NAFLD 提供科学数据。