电子束辐照对李斯特菌胞内组分及相关基因表达的影响

石菲菲 王 丽 崔晓瑞 张卫东 刘小飞 李凌燕 潘 妍 宋洪波 李淑荣*

（1 北京农业职业学院 北京102442 2 福建农林大学食品科学学院 福州350002 3 中国原子能科学研究院 北京102413）

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）为革兰氏阳性短杆菌，在自然界和各类食品中经常被发现，是一种人畜共患的食源性致病菌，感染该菌后可引起脑膜炎、急性胃肠炎、腹泻,甚至死亡等[1-3]。该菌具有较强的致病性，对各种应激条件（低温、高盐、低pH 等）有很强的耐受性，进一步增大了该菌的危害性[4]。英诺克李斯特菌（Listeria innocua）是另一种李斯特菌属，广泛存在于土壤和即食食品中[5]，对人类的致病性较小[6]。相关研究表明，英诺克李斯特菌与单增李斯特菌在血清、生理、形态方面有着高度的相似性，因此成为研究单增李斯特菌的良好替代模式菌[7]。

辐照杀菌技术是一种冷杀菌技术，近年来被广泛应用于食品杀菌领域，与传统的高温杀菌方法相比，该方法可较好地保留食品中的热敏成分，且杀菌彻底，目前应用于食品中的辐照源主要有3 种，即γ 射线、X 射线和电子束射线[8]。相对于其它辐射源，电子束设备辐照效率高，可操作性强，对食品品质破坏较小，安全性较高[9]。许多研究表明，电子束辐照对食源性致病菌具有良好的杀菌效果[10-13]。

傅里叶红外变换光谱技术作为一种综合检测细菌组分的有效方法，近年来得到广泛的应用，通过对细菌不同波数的红外吸收峰的分析，可以检测细菌在胁迫条件下胞内蛋白质、脂肪酸、碳水化合物、核酸和脂多糖等物质的变化情况[14-15]。实时荧光定量PCR（Real Time Fluorescence Quantitative，RT-qPCR） 技术是进行基因表达量测定较为简单、有效的方法[16]，具有光谱高敏感性以及定量精确等特点，可以对RT-qPCR 中荧光信号变化进行直接探测，从而得到定量结果，目前在生物学领域得到广泛的应用[17]。

目前国内外关于辐照杀菌致死效果的研究已比较深入，而对于辐照杀菌的致死机理研究仍有待深入。本试验中采用傅里叶变换光谱技术检测李斯特菌在辐照后胞内物质的变化情况，利用RT-qPCR 技术检测电子束辐照对李斯特菌DNA损伤修复、糖代谢以及毒力因子相关基因表达量的影响，以期从分子水平阐释电子束辐照对李斯特菌的致死机理，为电子束辐照应用于食品杀菌提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

英诺克李斯特菌（Listeria innocua）1.2990，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤培养基（TSBYE）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂培养基（TSAYE），北京陆桥技术有限责任公司；溴化钾，国药集团化学试剂有限公司；溶菌酶（100 mg/mL）、琼脂糖Agarose、50×TAE 缓冲液、Gold-View Ⅱ型核酸染色剂、100 bp DNA Ladder，北京索莱宝科技有限公司；RNApre Pure 培养细胞/细菌总RNA 提取试剂盒、Quant cDNA 第一链合成试剂盒、Talent 荧光定量检测试剂盒（SYBR Green）、RNase-Free DNase Ⅰ，北京天根生化科技有限公司。

1.2 设备与仪器

YXQ-LS-50SII 立式压力灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2F 洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LRH-150 生化培养箱，上海一恒科技有限公司；THZ-C恒温振荡器，太仓市实验设备厂；DK-S28 电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；FA2204B电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；SCIENTZ-II D 超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；R134A 型高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；TG16G 微型离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；TENSOR 27 傅里叶变换红外光谱仪，德国Bruker 公司；BIOMATE 3S 核酸浓度检测仪，赛默飞世尔科技公司；Smart Gel 140 一体化凝胶成像仪，北京赛智创业科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备 对真空冷冻干燥的英诺克李斯特菌种进行复苏与活化，平板划线培养1 d后获得单菌落，挑取一个单菌落于10 mL 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤培养基（TSBYE）中，摇床培养24 h【（36±1）℃，200 r/min】，以3%接种量接入100 mL TSBYE 液体培养基中，摇床培养12 h【（36±1） ℃，200 r/min】，以3%接种量接入1 000 mL TSBYE 液体培养基中，摇床培养9 h【（36±1） ℃，200 r/min】，8 000 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清液，用0.85%无菌生理盐水重复离心洗涤菌体沉淀3 次，调整菌悬液浓度为108CFU/mL，用10 mL 聚乙烯离心管分装。每个试验重复3次，置于4 ℃冰箱中待辐照。

1.3.2 电子束辐照处理 电子束辐照在电子加速器（中国原子能科学研究院）上进行。参数为：功率4 kW、能量10 MeV、扫描宽度50 cm、扫描速度1.5 m/min。设定剂量为0.00，0.75，1.50，2.25，3.00，3.75，5.00 kGy，辐照过程中用中国计量科学研究院标定的重铬酸钾银剂量计进行剂量跟踪，实测剂量为0.00，0.78，1.56，2.27，3.06，3.78，5.09 kGy。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱分析及曲线拟合 采用陈晨等[18]的样品处理方法，并做适当修改。辐照处理前、后的样品用无菌水洗涤2 次，离心（10 000 g，5 min），得到菌体沉淀，真空冷冻干燥。干燥后的菌体沉淀与溴化钾按质量比1∶100 充分混合，制成溴化钾压片，用FT-IR 谱仪对其分析，分辨率为4 cm-1，扫描次数64 次，测量范围4 000～500 cm-1。采用Peakfit 软件对酰胺Ⅰ带1 700～1 600 cm-1进行曲线拟合。

1.3.4 总RNA 提取与反转录 分别提取不同剂量辐照后李斯特菌的总RNA。总RNA 提取操作步骤参照北京天根RNApre Pure 培养细胞/细菌总RNA 提取试剂盒说明书，得到的RNA 用2%琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度检测仪检测其质量和浓度。

将提取的RNA 反转录为cDNA，反应体系为：500 ng RNA，2 μL 10×RT Mix，2 μL 超 纯dNTPs 混合液 （10 mmol/L），2 μL Oligo-（dT）15引物，1 μL 定量逆转录酶，加不含RNA 酶的ddH2O至20 μL，然后将混合均匀的混合液于37 ℃孵育60 min，85 ℃加热5 s，反转录完成的cDNA 于-20℃冰箱保存备用。

1.3.5 实时荧光定量PCR 扩增 在NCBI 网站上获得目的基因碱基序列，利用Primer Premier 5软件设计引物，见表1。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反应体系参照试剂盒说明书，采用三步法反应程序，反应条件为：95 ℃3 min预变性；95 ℃5 s 变性，60 ℃10 s 退火，72 ℃15 s 延伸，40 个循环。荧光信号采集在退火步骤进行。以未辐照组为对照组，采用2-△△Ct方法进行基因相定量分析，16S rRNA 作为内参基因。

表1 RT-PCR 反应引物序列Table 1 Primer of RT-PCR reaction

1.4 统计与分析

试验数据运用SPSS 17.0 统计软件进行单因素方差分析及LSD 多重检验法检验各组间差异的显著性（P<0.05，差异显著；P<0.01 差异极显著），数据结果以平均值±标准差（x¯±s）表示，采用Origin 8.5 绘图。

2 结果与分析

2.1 电子束辐照对李斯特菌胞内组分的影响

2.1.1 傅里叶变换光谱 不同处理条件下的英诺克李斯特菌胞内物质的原始红外谱图见图1。虽然各组的李斯特菌细胞从峰型和强度上表现不同，但是其基本趋势相同。红外吸收峰的峰位归属问题在分析细菌组分变化时发挥重要作用，峰位归属如下：3 000～2 800 cm-1脂肪酸、细胞膜相变化；酰胺I 带1 700～1 600 cm-1蛋白质二级结构变化；1 300～900 cm-1核酸骨架振动变化[18]。由于原始图谱变化微小，无法分辨峰型和峰位的具体变化情况，因此采用二阶导、去卷积曲线拟合等数学方法对图谱进一步分析。

图1 电子束辐照处理前、后英诺克李斯特菌红外光谱分析Fig.1 FTIR spectra analysis of L.innocua before and after electron beam irradiation treatment

2.1.2 红外光谱二阶导图谱 二阶导数处理是红外图谱中常用的方法。3 000～2 800 cm-1和1 300～900 cm-1区域的二阶导数谱图见图2。由图2a 可知，2 960 cm-1处的红外吸收峰发生明显的偏移，向高波数方向移动，当剂量大于0.75 kGy 时，2 935 cm-1和2922 cm-1处的吸收峰消失，2 852 cm-1处随着剂量的增加红外吸收强度变弱，3 000～2 800 cm-1代表甲基和亚甲基的反对称伸缩振动[19-20]。反对称伸缩振动谱带波数变大，说明脂类分子中碳氢链旁式构型增多，在一定程度上反映膜脂质双层无序变大。由图2b 可知，1 170，985，960，937，917 cm-1处，随着剂量的增加，红外吸收强度变弱，当剂量大于0.75 kGy 时，1 100 cm-1和1 115 cm-1处的吸收峰消失，说明核酸分子磷酸二脂基团的对称伸缩振动谱带发生改变。红外吸收变化说明辐照使细胞膜脂肪酸和核酸物质的构象发生变化，从而导致物质的变性[21]。这可能是由于辐射能量对化学键的直接作用或者自由基、活性氧引起的过氧化作用[22]。齐健[23]利用红外光谱研究了不同放射源对宫颈癌细胞的影响，与本试验结果一致。

图2 电子束辐照对英诺克李斯特菌的红外二阶导图谱Fig.2 Second-derivative FTIR spectra of electron beam irradiation on L.innocua

2.1.3 细菌蛋白定量分析 在红外光谱中，酰胺Ⅰ带（1 700～1 600 cm-1）谱峰研究得较为成熟[24]，代表C=O 的伸缩振动，对于研究蛋白质的二级结构最有价值，通过对其求二阶导、去卷积曲线拟合，可以定量得到蛋白质的二级结构[25]。酰胺Ⅰ区是一个很宽的吸收峰，这个谱带可以看成是几个峰形的组合，每个子峰都代表一种结构，有α 螺旋、β 折叠、转角和无规卷曲[26]，其中1 600～1 639 cm-1为β 折叠，1 640～1 650 cm-1为无规则卷曲，1 651～1 600 为α 螺旋，1 661～1 700 cm-1为β转角[27]。

二级结构含量见表2。未经辐照的英诺克李斯特菌蛋白的α 螺旋含量最高，随着电子束辐照剂量的增加，α 螺旋和β 转角结构含量相对减少，β 折叠结构和无规卷曲含量相对增加，这可能是由于辐照产生的自由基（H+、OH-、e-aq 等）与蛋白质之间有一定的交联作用，导致氢键作用力减弱，甚至在一定程度上引起氢键断裂[28]，使部分α 螺旋结构被拉伸而转变为β 折叠结构和无规卷曲，或者是破坏β 转角的稳定结构，从而导致蛋白二级结构的变化。这与王宁等[29]发现辐照氧化导致蛋白结构破坏的研究结果一致。

表2 电子束辐照对英诺克李斯特菌蛋白质二级结构的影响Table 2 The effect of electron beam irradiation on the secondary structure of L.innocua

2.2 电子束辐照对李斯特菌相关基因表达量的影响

2.2.1 RNA 样品质量分析 在基因表达量分析中，RNA 质量至关重要。OD260nm/OD280nm介于1.8～2.1 之间时，认为所提取的RNA 中蛋白质或者其它有机物的污染是可容忍的，当此值大于2.2 时，表明RNA 已经水解成单核苷酸，当此值小于1.8时，认为所提取的RNA 样品不可用，纯RNA 的OD260nm/OD280nm比值为2.0[30]。

图3 RNA 样品电泳检测结果Fig.3 The electrophoresis result of RNA sample

RNA 样品琼脂糖凝胶电泳质检结果如图1所示。各组样品均为3 条清晰条带（23S/16S/5S），23S 的亮度约为16S 的两倍，且5S 条带非常淡，说明RNA 样品完整性较好[31]。采用核酸浓度检测仪检测各组RNA 样品浓度，各组RNA 样品质量均大于100 μg，且OD260nm/OD280nm比值在2.0～2.1之间，满足实时荧光定量PCR 检测要求。

2.2.2 DNA 损伤修复相关基因recA 表达量的变化 各组recA 基因的相对表达量如图2所示。与对照组相比，各辐照组recA 基因表达均上调，除0.75 kGy 辐照组与对照组相比，表达量上调差异不显著（P＞0.05）外，其余组与对照组相比，表达量上调极显著（P＜0.01），说明电子束辐照对李斯特菌DNA 产生了一定的损伤，使recA 基因被激活，调控受损DNA 的诱变修复，导致遗传变异。辐照能诱导生物体产生过多的活性氧物质，如超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基和超氧化氢等，这些活性氧物质可与DNA 等大分子物质发生交联，致DNA 双链断裂。DNA 是电离辐射的靶分子，在细胞辐射损伤中起重要作用[32]。recA 基因是DNA 修复过程中的重要因子[33]，也是SOS 反应的激活因子[34]，是一种保守基因，参与DNA 的修复。

2.2.3 糖代谢相关基因lin1840 和GAPDH 表达量的变化 各组lin1840 和GAPDH 基因的相对表达量如图3所示。李斯特菌辐照初期，lin1840和GAPDH 两基因各辐照组与对照组相比表达均上调。0.75 kGy 和1.50 kGy 辐照组与对照组相比，lin1840 和GAPDH 基因表达量上调差异不显著（P＞0.05）。2.25 kGy 辐照组与对照组相比，lin1840基因表达量上调显著（P＜0.05），GAPDH 基因表达量上调极显著 （P＜0.01）。3.00，3.75 kGy 和5.00 kGy 辐照组与对照组相比，两基因表达量上调极显著（P＜0.01）。

lin1840 基因是编码β-葡萄糖苷酶的基因[35]。β-葡萄糖苷酶是一种能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键的水解酶，与生物体糖代谢途径相关，对维持生物体正常生理功能起着重要作用[36-37]，其大量表达，使菌体代谢异常，加速菌体的死亡。GAPDH 基因是编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因，细胞内正常水平的GAPDH 不引起凋亡，当其大量表达时，导致胞内蓄积，诱导细胞凋亡[38-39]。本试验结果表明：电子束辐照影响李斯特菌糖代谢水平，在一定剂量范围电子束辐照对细胞产生明显的刺激作用，使lin1840 和GAPDH 基因大量表达，这与何颖等[40]的研究结果一致。

图4 recA 基因相对表达量的变化Fig.4 The change of relative expression of recA gene

图5 lin1840 和GAPDH 基因相对表达量的变化Fig.5 The change of relative expression of lin1840 and GAPDH gene

2.2.4 毒力相关基因iap、inlC 表达量的变化 各组iap 和inlC 基因的相对表达量如表2所示。与对照组相比，iap 和inlC 基因表达均下调。Iap 基因在李斯特菌辐照后，除0.75 kGy 辐照组与对照组相比表达量差异不显著（P＞0.05）外，其余组与对照组相比，表达量下调极显著（P＜0.01）。inlC 基因在李斯特菌辐照后，各辐照组与对照组相比，表达量下调极显著（P＜0.01）。

李斯特菌是典型的兼性胞内寄生菌，可通过一些毒力因子在巨噬细胞和许多非吞噬细胞（如上皮细胞、内皮细胞和肝细胞）内增殖[41]。iap 基因编码p60 蛋白，p60 蛋白是由李斯特菌产生的一种胞外蛋白，具有水解酶和酰胺酶活性，对于李斯特菌的吞噬细胞溶解作用以及对机体的感染过程，该蛋白是一个重要的因素[42-43]。InlC 是内化素家族的成员之一，inlC 基因编码的蛋白与李斯特菌进入肠道有关[44]。本研究结果表明：电子束辐照可以降低李斯特菌毒力基因的表达，推测电子束辐照可以降低李斯特菌的毒性，这与张婷[44]对灰葡萄孢病菌（Botrytis cinerea）进行电子束辐照后致病力降低相一致。

图6 Iap 和inlC 基因相对表达量的变化Fig.6 The change of relative expression of iap and inlC gene

3 结论

本研究结果表明电子束辐照后，李斯特菌胞内组分、细胞膜脂肪酸和核酸物质发生变性，蛋白质二级结构发生变化，无序性增加。电子束辐照对李斯特菌相关基因表达量影响显著，DNA 损伤修复相关基因表达量表现为上调。由此可见电子束辐照使李斯特菌DNA 损伤，并与红外检测结果一致。糖代谢相关基因lin1840 和GAPDH 分别编码β-葡萄糖苷酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶，其大量上调，使糖代谢紊乱，促使细胞凋亡，毒力相关基因表达量表现为下调。综上可知，电子束辐照可导致李斯特菌胞内物质变性，并可诱导基因表达异常，从而可能加速菌体的死亡。