标准菌株CMCC（B）40001的分类学研究

都海渤 刘佳奇 张 欣 李 婷 李金霞 姚 粟

（中国食品发酵工业研究院有限公司 中国工业微生物菌种保藏管理中心 北京100015）

标准菌株CMCC （B） 40001 保藏于中国医学细菌菌种保藏管理中心，来源于第二军医大学，从2013年开始，作为培养基质控菌株被GB 4789.28-2013 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》指定为标准菌株，用于葡萄糖发酵管、改良克氏双糖的质控[1]。目前在公开的文献中，未能检索到该菌株的分离和鉴定研究信息。

1986年，De Ley 等[2]研究了支气管炎鲍特氏菌 （Bordetella bronchiseptica）模式菌株NCTC 452T、粪产碱（杆）菌（Alcaligenes faecalis）模式菌株NCIB 8156T、木糖氧化产碱菌脱氮亚种（Alcaligenes xylosoxidans subsp.denitrificans） 模式菌株ATCC 15173T以及一些其它鲍特氏菌和产碱菌的基因型和表型，认为鲍特氏菌属和产碱菌属的亲缘关系相近，建立产碱菌科（Alcaligenaceae）。初建时只有两个菌属，即产碱菌属和鲍特氏菌属。粪产碱菌和支气管炎鲍特氏菌同属产碱菌科，二者形态和表型特征相近。

本文采用形态学分析、16S rRNA 基因序列分析、MALDI-TOF 质谱分析、VITEK 2 COMPACT全自动微生物分析和API 试剂条等技术，对CMCC（B） 40001 进行多相复核鉴定，以确定标准菌株的科学性和准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种来源 标准菌株CMCC （B） 40001 来源于中国医学细菌菌种保藏管理中心，在中国工业微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CICC 10981。

1.1.2 培养基及主要试剂 哥伦比亚血琼脂平板，北京陆桥技术有限责任公司；TSA，OXID；VITEK 鉴定卡、API 20NE，法国生物梅里埃公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP、D2000 Marker，天根生化科技有限公司；GoldView，北京塞百盛基因技术有限公司；溶菌酶，Sigma 公司；蛋白酶K，Merk 公司；其它化学药品均为进口色谱纯产品。

1.2 方法

1.2.1 形态学观察 将供试菌株接种于TSA 平板上，30 ℃培养48 h。取新鲜菌体进行革兰氏染色并镜检，染色方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[3]。同时进行扫描电镜切片并镜检、拍照。

1.2.2 16 S rRNA 基因序列分析 利用细菌基因组DNA 提取试剂盒（Tiangen 公司）提取菌株CMCC（B） 40001 基因组DNA，具体步骤参见试剂盒说明书。以基因组DNA 为模板，利用通用引物F27/1492R 扩增16S rRNA 基因[4]。测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。测序结果用Chromas 软件参照正、反序列图谱人工校对，测序结果在EzTaxon 数据库中进行比对[5]，确定与已知近缘种序列的相似性。采用CLUSTAL W 对CMCC（B） 40001 及其若干近缘种16S rRNA 基因序列进行多序列比对[6]，并利用N-J 法通过MEGA 5软件进行系统发育树分析[7]。

1.2.3 MALDI-TOF 质谱分析 挑取新鲜培养的CMCC（B） 40001 单个菌落，均匀涂抹于96 孔不锈钢靶板上，晾干。吸取1μL HCCA 基质液于每个样本上，晾干，将靶板立即放入MALDI-TOF 质谱仪进行分析。分析软件：Bruker MBT compass Version 4.1.60、flex control 3.4；方法：MBT-FC；扫描范围：2 000～21 000 m/z；菌种库：Bruker MBTDB5989。在鉴定报告中得分2.00～3.00 为高可信度鉴定，1.70～1.99 为低可信度鉴定；0.00～1.69 标明无鉴定结果。

1.2.4 生理生化特征试验 分别采用VITEK 2 COMPACT 全自动微生物分析系统和API 试剂条对CMCC（B） 40001 进行生理生化试验。使用GN鉴定卡，按照VITEK 2 COMPACT 系统的标准操作流程进行菌种培养、菌液配制和上机操作。

采用API 20NE 试剂条对CMCC （B） 40001的碳源利用及其产酸情况、酶活性等生理生化特征进行检测，具体操作方法按试剂条使用说明书进行。

2 结果与分析

2.1 形态学观察

菌株CMCC（B） 40001 在TSA 培养基上，菌落呈黄色，不透明，圆形，表面光滑（见图1a）。用光学显微镜观察显示菌体细胞呈短杆状，单个或成对排列，革兰氏染色阴性（见图1b）。用菌体电子显微镜观察，菌体长度0.5～1.5 μm，宽度0.3～0.4 μm，扫描电镜成像效果见图1c。

图1 菌株CMCC（B） 40001 形态学观察结果Fig.1 Morphological observation of strain CMCC（B） 40001

2.2 16S rRNA 基因序列分析

将测序得到的菌株CMCC（B） 40001 的16S rRNA 基因序列信息提交至GenBank，获得登录号MH036510。以Kerstersia gyiorum LMG 5906T（AY131213）为外群，构建CMCC（B） 40001 与相关近缘模式菌株的系统发育树（见图2）。

由系统发育分析确定CMCC（B） 40001 应为鲍特氏菌属（Bordetella sp.），与支气管炎鲍特氏菌（B.bronchiseptica）、副百日咳鲍特氏菌（B.parapertussis）、百日咳鲍特氏菌（B.pertussis）、霍氏鲍特氏菌（B.holmesii）、欣氏鲍特氏菌（B.hinzii）、鸟鲍特氏菌（B.avium）模式菌株亲缘关系较近，16S rRNA 基因序列相似性分别为100.00%，99.93%，99.64%，99.49%，99.35%，98.69%，均高于原核微生物种的界限98.65%[8]。

2.3 MALDI-TOF 质谱分析

应用MALDI-TOF MS 质谱仪对CMCC（B）40001 进行快速菌种鉴定，得出鉴定结果为支气管炎鲍特氏菌，与数据库中模式菌株DSM 13414T匹配得分为2.33，表明鉴定结果非常可信，其与菌种库中支气管炎鲍特氏菌模式菌株DSM 13414T谱图对比图见图3。

图2 菌株CMCC（B）40001 16S rRNA 基因系统发育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of strain CMCC（B）40001 16S rRNA gene

图3 菌株CMCC（B） 40001 与DSM 13414T 图谱对比图Fig.3 Contrast diagram of strain CMCC（B） 40001 and DSM 13414T

2.4 生理生化特征鉴定

VITEK 2 COMPACT 全自动微生物分析系统的鉴定结果见表1，鉴定结论是支气管炎鲍特氏菌（Bordetella bronchiseptica），鉴定概率百分比是99%。

菌株CMCC（B） 40001 的酶活性、碳源利用及其产酸情况等生理生化特征结果详见表2。菌株CMCC（B） 40001 硝酸盐还原、脲酶、细胞色素氧化酶阳性，不液化明胶；可同化己二酸、柠檬酸和苯乙酸，不能利用葡萄糖产酸，不能利用阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰葡糖胺等碳源物质。鉴定结论是支气管炎鲍特氏菌 （Bordetella bronchiseptica），鉴定百分率是99.8%。

表2 CMCC（B） 40001 生理生化特征API 检测结果Table 2 API test of strain CMCC（B） 40001

2.5 标准菌株CMCC（B） 40001 分类鉴定结论

依据形态学分析、16S rRNA 基因序列分析、MALDI-TOF 质谱分析、VITEK 2 COMPACT 全自动微生物分析和API 试剂条技术，标准菌株CMCC（B） 40001 被鉴定为支气管炎鲍特氏菌（Bordetella bronchiseptica），与GB 4789.28-2013 收录的名称粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）不一致。

3 讨论

菌株CMCC（B） 40001 作为标准中的参考菌株，对其准确鉴定至种水平后按特征分类和描述，对于完善标准的科学性和标准之间的协调性具有重要意义。

伯杰氏系统细菌学手册》第2 卷[9]，粪产碱菌（Alcaligenes faecalis） 与支气管炎鲍特氏菌（Bordetella bronchiseptica）主要是脲酶试验结果不同，粪产碱菌脲酶试验阴性，支气管炎鲍特氏菌脲酶试验阳性[10]，其它生理生化特征相近。GB 4789.28使用菌株CMCC（B） 40001 作为改良克氏双糖和葡萄糖发酵培养基的质控菌株，利用其不能利用葡萄糖、山梨醇产酸和不产生硫化氢的特性进行培养基质量控制。

支气管炎鲍特氏菌是一种动物病原菌，可引起猪、牛、兔、犬等哺乳动物的多种呼吸系统疾病，并可协同其它病原微生物形成严重的肺部混合感染[11-14]。《人间传染的病原微生物名录》（中华人民共和国卫生部2006年1月11日制定）[15]中将其危害程度分类定为第3 类，试验时所需生物安全实验室级别是BSL-2。粪产碱菌并未收录于该名录中，表明其为非病原微生物。美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）[16]依据《美国公共卫生服务指南》（U.S.Public Health Service Guidelines） 将支气管炎鲍特氏菌的生物安全级别定为2 级，粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）定为1 级。综上建议再次修订GB 4789.28 时更换一株生物安全性更高的粪产碱菌CICC 20142 作为标准菌株。