醇酰基转移酶催化合成白酒中的乙酸乙酯研究进展

范光森 王允中 刘朋肖 吴秋华 富志磊 朱宇婷 成柳洁 李秀婷*

（1 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京工商大学 北京100048 2 北京市食品添加剂工程技术研究中心 北京工商大学 北京100048 3 北京工商大学食品与健康学院 北京100048 4 中国食品发酵工业研究院有限公司 北京100015）

白酒是我国传统发酵食品的典型代表，其起源和发展深刻影响了中华文明的历史文化，在国民的日常生活中占据举足轻重的地位。纵观白酒产业的发展进程，每一阶段的发展成就均依赖于传统酿造工艺改造、技术革新和理念创新。然而，自2010年起，我国白酒产业增速逐步放缓，表观原因在于生产周期长，出酒率和优质率低，品质批次稳定性差，大规模工业化生产难以实现，相对成本上升等，究其实质是由于我国传统白酒酿造的开放式生产方式所致的群体微生物共存、固态发酵过程迭代演替以及多相体系转化等复杂而多样的机理尚不明晰，实际生产过程中存在的问题难以得到科学理论的支撑，从而导致我国传统酿造工艺技术的传承和工艺改进陷入瓶颈，严重影响白酒生产品质的提升，制约了白酒产业的升级与发展[1]。

大量研究表明，酯类化合物是决定白酒风格与品质的关键物质，其中作为四大酯之一的乙酸乙酯在各香型白酒中含量较多，处于风味酯的主导地位，尤其对浓香型、清香型、米香型和凤香型等酒的风格形成有重要作用，是浓香型白酒四大骨架酯之一，也是清香型白酒的主体香[2-4]。此外，乙酸乙酯是唯一一种在各香型白酒的国家标准中有明确指标规定，用于评判白酒香型和优劣的酯类化合物，是区别不同质量等级白酒的重要指标[5]。基于乙酸乙酯在白酒酯类中的重要性，关注并解析其在白酒酿造过程中形成的影响因素和机理，对于提高白酒中酯类含量并使其比例协调，增强白酒品质稳定性，提升产品品质，进而推动传统白酒酿造产业的技术革新具有重要现实意义。

1 传统白酒乙酸乙酯的形成及影响因素

由于乙酸乙酯对白酒香型归属和品质优劣至关重要，研究者和生产企业都十分重视白酒中乙酸乙酯的产生、形成影响因素和内在机制的研究。白酒酿造过程中，乙酸乙酯的合成途径有化学合成和生物合成，由于化学合成的底物浓度要求高，合成速度慢且合成量低，因此生物合成是白酒中乙酸乙酯主要来源[6]。何种微生物能够合成白酒中的乙酸乙酯，成为解析其形成机制的首要问题。目前，有关白酒中乙酸乙酯的研究也主要集中于乙酸乙酯产生功能微生物筛选、培养条件优化和功能微生物强化等，并取得了较好的结果（表1）。白酒酿造过程中酵母、细菌和霉菌的多个种均能产生乙酸乙酯，在如此众多菌株中，产香酵母（产酯酵母）是最重要的乙酸乙酯产生菌[7]，也是白酒酿造过程酯类来源的重要微生物[8]。该类酵母具有较强的产酯能力，主产乙酸酯类，特别是乙酸乙酯，能够产生以酯香为主的多种香味，对改变酒体的风味组成，赋予酒体浓郁的芳香及促进酒体的丰满具有重要作用，堪称白酒酿造的“风味调剂师”[9]。目前，产香酵母在浓、酱、清、豉、特、老白干等香型白酒生产应用方面起到较好的效果，提高了不同香型白酒的总酯和四大乙酯含量，使酒体醇厚、诸香协调[9-11]。

表1 白酒酿造过程中乙酸乙酯产生菌株Table 1 Strains of ethyl acetate produced during the brewing of Baijiu

2 醇酰基转移酶在白酒乙酸乙酯合成中的作用

有关白酒酿造过程中乙酸乙酯合成的机制虽缺乏研究，但微生物的生理活动是白酒酿造中酯类物质产生的主要途径已是无容置疑的事实，其实质是各种相关生物酶作用的结果[6]。在这些生物酶中，“酯化酶” 对白酒酯类形成起到最重要的作用[30]。大多研究普遍认为“酯化酶”是脂肪酶和酯酶的统称。然而，近年的研究表明，在酵母细胞中，醇酰基转移酶（AATase）在乙酸酯的生物催化合成中发挥了重要的作用。该酶催化醇类和乙酰辅酶A 生成乙酸酯，是酵母合成乙酸酯类 （如乙酸乙酯、乙酸异戊酯等）的关键酶[6，31]。研究者现已认识到醇酰基转移酶也是“酯化酶”的重要成员，在白酒酯类形成中发挥着重要功能。

醇酰基转移酶是BAHD 家族酰基转移酶中的成员，目前植物来源的醇酰基转移酶研究比较充分，它是众多植物中挥发性酯类化合物合成的关键酶[32]。有关酵母中该酶产酯的研究也日益增多，大多集中于啤酒、葡萄酒、清酒等酒饮品中酿酒酵母合成酯类。醇酰基转移酶在上述酒饮品中酯类的合成方面发挥了决定作用，是其关键因素（表2）。例如，Lilly 等[33-34]过量表达酿酒酵母醇酰基转移酶基因ATF1 后，酿酒酵母所产乙酸乙酯含量增加。Fujii 等[35]敲除ATF1 基因后，酿酒酵母产乙酸乙酯量降低了30%以上。通过SED1 启动子过量表达清酒酵母中醇酰基转移酶基因ATF2，突变菌株所产乙酸异戊酯含量相比亲本提高了1.4 倍[36]。Stribny 等[37]研究发现ATF1 对乙酸苯乙酯合成具有重要作用，而ATF2 对乙酸异丁酯、乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯有重要作用。

随着对白酒酯类，尤其是乙酸乙酯形成机理认识的深入，国内部分学者开始关注醇酰基转移酶在白酒酯类形成过程中所起的作用。如：Cui 等[3]过表达醇酰基转移酶基因ATF1 后，改造菌株A28所产乙酸乙酯是亲本的27.21 倍，达270.24 mg/L。郑楠等[7]在敲出ACH1 基因、过表达ACS1 和ACS2 基因基础上过表达ATF1 基因，得到的工程菌相比亲本菌株最高提升530.43%。Li 等[38-39]考察了ATF1、ATF2 和Lg-ATF1 过表达后乙酸乙酯的产量，结果过量表达ATF1 工程菌株乙酸乙酯产量大幅提高，是亲本菌株的43.16 倍。李锋等[40]对酿酒酵母醇己酰基转移酶基因EHT1 进行过表达，己酸乙酯的产量提高为原菌种的2.21 倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯也分别提高了31.4%和49.1%。Dong 等[41]过量表达酿酒酵母ATF1 后，产酯能力提高，由25.04 mg/L 增至78.76 mg/L，为亲本菌株的3.1 倍。马红霞等[42]将过表达醇乙酰基转移酶并敲除乙酸酯水解酶编码基因的酿酒酵母应用到清香型白酒酿造中，明显提高乙酸乙酯含量。由此可见，醇酰基转移酶对白酒中乙酸乙酯等酯类的合成发挥了非常重要的作用。值得注意的是，已有醇酰基转移酶合成酯类的研究集中于酿酒酵母，而有关产香酵母的研究较少。从醇酰基转移酶角度探究白酒中酵母，尤其是产香酵母合成乙酸乙酯的分子机制，有助于系统、全面和科学正确地认识产香酵母合成白酒酯类的内在机制，促进产香酵母调控白酒酯类形成，提高白酒的品质。

研究发现，醇酰基转移酶在酵母菌中存在多态性，即由不同基因表达不同特性的酶蛋白，这些酶蛋白所发挥的酯类合成功能存在差异，即使相同基因，在不同菌株中所呈现的功能特性也有差异（表2）。Fujii 等[35]研究发现缺失ATF1 的酿酒酵母，以异戊醇为底物时，酶活力仅保留20%，而以乙醇为底物时，酶活力保留率达80%，发酵试验表明，乙酸乙酯含量能达到对照的60%以上，这表明除了ATF1 外，还存在另外的醇酰基转移酶，而且ATF1 对乙酸乙酯合成的影响较小。Verstrepen 等[47]过量表达或敲除酿酒酵母中ATF1、ATF2 和Lg-ATF1 基因，结果表明ATF1 和ATF2 对乙酸乙酯合成影响较大。Lilly 等[34]分别过量表达酿酒酵母中ATF1、ATF2 和EHT1，结果发现，ATF1 对乙酸乙酯合成的影响最大，其次是ATF2，而EHT1 主要影响己酸乙酯含量。此外，不同的酵母所含有的醇酰基转移酶也不尽相同。目前报道的酵母菌醇酰基转移酶的基因包括ATF1、ATF2、Lg-ATF1、EHT1、EAT1 和EEB1，有关这些基因表达的醇酰基转移酶在酯类合成的功能研究多源于酿酒酵母，在传统酿造过程中乙酸乙酯的主要产生菌——产香酵母中是否存在这些酶类，如存在它们又是如何发挥酯类合成作用的（图1），至今仍不清楚，有待深入研究。研究白酒酿造过程中醇酰基转移酶形成乙酸乙酯的作用机制，可依据有关酿酒酵母的研究思路展开（图1），在明晰产香酵母内何种醇酰基转移酶对乙酸乙酯合成起到关键作用的基础上，进一步探究该酶催化合成乙酸乙酯的分子机制，为科学解释并调控传统白酒酿造过程酯类化合物的形成提供基础数据。

3 醇酰基转移酶在白酒中酯类合成的功能特性

尽管研究者认识到醇酰基转移酶在催化合成白酒酯类化合物方面的作用，尝试从结构方面对其催化酯类合成机制进行解析，然而至今尚未有该类酶晶体结构的报道。目前尚未确定其催化活性位点以及功能区域。2005年，Ma 等[62]获得了与醇酰基转移酶同家族的维诺任碱合酶（Vinorine synthase）的晶体，为醇酰基转移酶结构及催化酯合成机制的解析提供了参考。分析维诺任碱合酶晶体结构发现，包含醇酰基转移酶在内的BAHD家族的酶蛋白保守序列HXXXD 位于酶的活性中心位置，其中His160 不仅与Asn293 侧链形成氢键，还与主链上的2 个羰基氧形成氢键，这种结构对整个催化反应起到重要的作用，而保守序列DFGWG 位于β11 和β13 之间的转角处，接近C端，其上的Asp362、Trp365 和Gly366 都与主链上的酰胺基团形成氢键，从而维持一个转角结构，而这一转角结构可能对结合底物CoA 具有重要作用，是形成结合底物CoA 的完整结构的重要结构单元（图2）。

献文[43][44][45][46][33][47][48][49][50][51][34][52][53]/间时份年1981 1993 1994 1998 2000 2003 2003 2004 2004 2006 2006 2006 2008地兰类酒酒品品品、白酒酒品酒酒酒酒萄饮酒饮酒饮萄果饮状现究研的中成合类酯品饮酒在酶移转基酰醇2表Research on alcohol acyltransferase in the synthesis of esters in alcoholic beverages Table 2 性特株菌酶啤活类醇C 3对且，并链支于优性特化催类醇链直-C 6 C 1对（Saccha-菌母酵汁萄葡AATase类醇它其于低性）romyces uvarum清类醇链长对且，并链支于优性特化催类醇链直-C 5 C 2对（Saccharomyces母酵酒酿AATase类醇链短于优性活）cerevisiae啤9高提酯乙酸，乙倍27高提酯戊异酸乙AFT1贝拷多菌母酵汁萄葡AATase酯乙酸，乙倍17高提酯戊异酸乙Lg-ATF1贝拷；多倍倍2高提清丁异酸、乙酯戊异酸、乙酯乙酸，乙数贝拷的ATF1加增母酵酒酿AATFase高提量含酯葡量含酯乙苯酸乙和酯戊异酸、乙酯乙酸，乙ATF1达表过母酵酒酿AAT倍10和倍，12 10高提别分酒，大响影酯戊异酸乙和酯乙酸乙对仅不ATF2和AFT1母酵酒酿和、Atf2p Atf1p庚酸、乙酯己酸、乙酯戊酸、乙酯丁异酸、乙酯丙酸乙对Lg-Atf1p更果效；AFT1响影要重有也酯乙苯酸乙和酯辛酸、乙酯好啤大响影量含类酯酒啤，对后ATF1达表量过母酵酒酿AATase I酒加增质物类酯酸，乙ATF1 后达表量过母酵酒酿Atf1p清高提量产酯戊异酸，乙后ATF1达表量过）（sake yeast母酵酒清AATFase酒量含酯乙酸肪脂链，中EEB1和EHT1失缺同共或独单母酵酒酿Eeb1和Eht1降下葡苯酸、乙酯戊异酸、乙酯乙酸乙高提著显ATF1达表过母酵酒酿和、Atf2p Atf1p异酸乙和酯乙酸乙对则ATF2达表；过酯乙酸己和酯乙Eht1p酸、辛酯乙酸己高提著显则EHT1达表；过小响影酯戊酯乙酸癸和酯乙苹性异特有具成合酯乙苯酸乙对母酵生汉孢有皮尔法AATase（Hanseniaspora valbyensis）酒表量，过量含质物类酯酸乙加增量大能ATF1达表量过母酵维鲁克酸乳Atf2和Atf1质物类酯酸乙加增量适可ATF2达）（Kluyveromyces lactis因基--Lg-ATF1和AFT1 ATF1 AFT1和、ATF2 AFT1 Lg-ATF1 ATF1 ATF1 ATF1 EEB1和EHT1和、ATF2 ATF1 EHT1-ATF2和ATF1

献文[54][36][55][56][57][58][59][40][60][41][37][61][31][39][38][7][3]间/时份年2008 2009 2012 2012 2013 2014 2014 2014 2014 2014 2016 2016 2017 2017 2018 2018 2018类酒酒果酒酒酒酒酒酒酒酒酒酒酒酒酒酒酒苹清黄啤啤黄黄白白白啤啤-白白白白性特性异特有具成合酯乙苯酸乙对倍1.4高提量含酯戊异酸，乙ATF2达表过丁异酸乙和酯戊异酸、乙酯乙酸乙高提能ATF1达表过量含酯乙酸，乙BAT2酶氨转酸基氨除敲时同并ATF1达表过5.52 mg/L到高提酯戊异酸，乙倍6.43了高提酯11.5了高提酯乙酸BAT2，乙除敲时同ATF1 并达表过9.25 mg/L 到高提酯戊异酸，乙倍，中母酵酒黄至达表和隆克中S-6母酵酒啤从Lg-ATF1高提量的酯戊异酸乙和酯乙酸乙产母酵酒黄达酯戊异酸，乙倍4.9加增量含酯乙酸，乙ATF2达表过7.60 mg/L达酯丁异酸，乙26.68 mg/L和酯乙酸，辛倍2.21高提量产酯乙酸，己株变突达表过49.1%和31.4%高提别分酯乙酸癸高提量含酯乙酸FAA1，己除敲时同EHT1 并达表量过加增量含酯乙酸52%，癸加增量含酯乙酸，辛2.97 倍61%78.76 mg/L至增25.04由量含酯乙酸，乙ATF1达表过丁异酸乙对；Atf2用作要重有具成合酯乙苯酸乙对Atf1用作要重有酯乙苯酸乙和酯戊异酸、乙酯联关的好很有具间之ATF1与酯乙酸乙量含酯乙酸乙高提能Eat1达表过高提量含酯乙酸乙后ATF1达表过酯乙酸乙产母酵酒酿高提著显能ATF2和ATF1达表过有没则Lg-ATF1，而显明为更ATF1因基是其，尤力能响影著显力能酯乙酸乙成合母酵酒酿高提以可ATF1达表过本亲，是270.24 mg/L到达量含酯乙酸乙后ATF1达表过27.21 倍的株菌母酵生汉孢有皮尔法母酵酒清母酵酒酿母酵酒酿母酵酒啤母酵酒黄母酵酒黄母酵酒酿母酵酒酿母酵酒酿（Saccha-母酵夫亚里德库）romyces kudriavzevii母酵酒啤麦小（Wick-母酵姆汉克威常异erhamomyces anomalus）母酵酒酿母酵酒酿母酵酒酿母酵酒酿酶AAT AATase AATase AATase AATase AATase AATase酶移转基酰己ethanol hexanoyl transferase AATase Atf2和Atf1-Eat1 AATase、ATF2 ATF1 Lg-ATF1和AATase AATase）2表（续因基-ATF2 ATF1 ATF1 ATF1 Lg-ATF1 ATF2 EHT1 EHT1 ATF1 ATF2和ATF1 ATF2和ATF1 Eat1 ATF1和、ATF2 ATF1 Lg-ATF1 ATF1 ATF1

图1 酵母醇酰基转移酶催化合成乙酸乙酯机制解析Fig.1 Mechanism of the synthesis of ethyl acetate catalyzed by alcohol acyltransferase from yeasts

图2 Vinorine synthase 晶体结构及保守序列Fig.2 Crystal structure and conservative sequence of Vinorine synthase

Vinorine synthase 晶体结构的获得使模拟研究功能未知的BAHD 成员，尤其是醇酰基转移酶三维结构并解释其分子催化机制成为可能。目前，依据该晶体为模板，通过同源建模方法得到少量植物来源的醇酰基转移酶三维结构，并利用分子对接理论推测其合成酯的分子机制。Morales-Quintana 等[63]同源建模获得木瓜来源的醇酰基转移酶VpAAT1 的蛋白结构，利用分子对接理论推测其合成酯类化合物的催化机制为：位于催化活性中心的保守序列 （HXXXD） 上的组氨酸残基His166，引起相应受体上的O 原子或N 原子脱掉质子，亲核进攻CoA 硫酯上的羰基碳，醇类化合物则和Asp170 结合，从而形成CoA 与受体之间的一个四面体中间体，该中间体质子化后CoA 脱下来即得到酯类化合物或者酰胺（图3）。然而，目前的研究成果仅对于解析植物醇酰基转移酶合成相关酯类化合物的机制有重要作用，酵母来源的醇酰基转移酶仅见Saerens 等[51]对EHT1 和EEB1表达的醇酰基转移酶进行结构模拟的研究报道，尚未开展酯合成催化机制的研究，该酶保守序列的功能及催化活性位点也尚未解析。由此，基于酵母菌醇酰基转移酶合成酯类催化机制大多从动力学常数表观层面推测，未从酶分子结构、功效本质层面揭示的现状，从蛋白结构本质入手，通过基因工程和酶工程探究产香酵母醇酰基转移酶保守序列和催化活性位点功能，揭示其催化合成乙酸乙酯的分子机制，是今后研究的热点之一。

图3 木瓜来源的醇酰基转移酶VpAAT1 结构、活性中心和底物结合区域示意图Fig.3 Schematic diagram of structure，catalytic residues and ligand binding of alcohol acyltransferase VpAAT1 from papaya fruit

4 小结与展望

产香酵母是白酒中乙酸乙酯的主要产生菌株，然而，有关其合成乙酸乙酯的机制尚不清楚。随着人们对白酒乙酸乙酯研究的深入，醇酰基转移酶在酵母合成乙酸乙酯中的作用受到重视。当前，有关醇酰基转移酶发挥酯合成作用的研究主要集中于酿酒酵母，而白酒酿造工艺不同于其它酒饮品，需探究产香酵母合成酯类的机理。随着多组学技术的发展，可以通过全基因组测序获悉产香酵母中醇酰基转移酶基因，然后，通过转录组学从多个醇酰基转移酶基因中获得关键酯类化合物合成的酶，再通过代谢组学和蛋白质组学进一步验证，最后对酯类化合物合成的关键醇酰基转移酶进行克隆表达及相应酶学性质研究，探究其合成酯类化合物的分子机制。另外，不仅可以从分子角度解析单一菌株中酯类合成的机制，而且白酒酿造整个过程中酯类化合物合成不同阶段的关键菌株-关键基因-关键酶之间复杂联系的全面解析也将成为现实，进而明确白酒酿造过程中更多其它风味物质的合成机制，为科学调控传统白酒酿造过程提供理论依据。