组方优化的阳和胶囊对碘乙酸钠诱导大鼠骨关节炎的作用研究

洪 铁*，王丹妮，张 宸 ，高贤娴，吴 岩

(1.吉林大学药学院药理教研室，长春130021；2.吉林省中医药科学院，长春130012）

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种常见的关节退行性疾病，以慢性关节软骨降解及丢失为主，其病理改变常为关节边缘及软骨下骨骨质增生、关节滑膜损伤及炎性细胞的大量聚集。临床主要表现为关节疼痛、僵硬、肿胀，严重时关节畸形可引起运动功能障碍。已有研究表明，膝骨关节炎是40岁以后最常见的慢性、进展性、退行性骨关节炎[1]。然而目前，根据中华医学会风湿病学分会制定的骨关节炎诊治指南可使用的药物只有用于控制症状的非甾体抗炎药及改善病情的双醋瑞因、硫酸氨基葡萄糖、玻璃酸钠等，这提示控制炎症及改善关节软骨病变是治疗骨关节炎的首要目标[2]。

组方优化的阳和胶囊是吉林省中医药科学院骨科专家以传统中医药理论为指导，根据长期临床实践总结出的经验方。全方由补骨脂、熟地、牛膝、生姜、麻黄、肉桂、白芥子、延胡索等多味中药组成，具有温经通络、祛湿散寒、强筋健骨、去痹止痛的功效，是吉林省中医药科学院院内制剂，已在老年原发性骨质疏松症[3～4]、腰椎间盘突出症[5]等疾病治疗中取得较好的疗效。膝关节腔内注射碘乙酸钠是常用的化学物质诱导型关节炎模型，其可引起软骨基质的改变，使关节软骨降解和丢失，类似于人骨关节炎病变过程[6]。本研究通过构建大鼠膝骨关节炎模型以研究组方优化的阳和胶囊治疗骨关节炎的作用，并探讨其调控炎症因子表达的机制，为骨关节炎的临床治疗提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠，雄性，50只，体质量220～250 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，将动物于动物室适应性饲养1周，温度为20～24℃，湿度为40%～70%，12h明暗交替照明，给予维持饲料，自由饮水。

1.2 实验试剂

碘乙酸钠由上海麦克林生化科技有限公司生产；双醋瑞因胶囊由昆明积大制药股份有限公司生产；大鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供；大鼠前列腺素E2（PGE-2）ELISA试剂盒、大鼠总一氧化氮检测试剂盒由上海碧云天生物技术有限公司提供；大鼠基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）ELISA试剂盒由武汉默沙克生物科技有限公司提供。

1.3 实验仪器

全波长酶标仪，Biotek公司；手持式高速匀浆机，上海巴玖实业有限公司；BS124S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；3-18k低温高速冷冻离心机，Sigma公司；XPX-9052 MBE数显不锈钢电热培养箱，上海博迅实业有限公司。

2 方法

2.1 分组给药与动物模型的建立

将50只Wistar雄性大鼠，按体重随机分为6组，模型组10只，其余各组8只。分别为正常对照组，模型（4%碘乙酸钠溶液）组，阳性对照双醋瑞因胶囊（8.0mg/kg）组，组方优化的阳和胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组。大鼠分笼饲养。

大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，双膝关节备皮后75%乙醇常规消毒。除正常对照组外其余各组大鼠双膝关节腔内注入0.1ml 4%碘乙酸钠溶液诱导大鼠骨关节炎模型，1次/d，连续注入7d；正常对照组注射等体积生理盐水。在末次膝关节腔内注射4%碘乙酸钠溶液后，阳性对照组及各给药组分别灌胃给予相应浓度受试药，模型组、正常对照组灌胃给予等体积0.5%CMC-Na溶液，每日1次，共计给药4周。

2.2 观测指标

2.2.1 大鼠膝关节宽度变化

测量造模前、给药前，以及给药第 1、2、3、4 周的大鼠膝关节宽度（mm），每只大鼠测量3次取平均值，按照以下公式计算关节肿胀度：

关节肿胀度(mm)=致炎后（给药后）膝关节宽度(mm)-致炎前膝关节宽度(mm)

2.2.2 大鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量测定

大鼠按体重腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，行腹主动脉取血，血液静置45min后在4℃，3500r/min条件下离心15min取上清，分离血清后进行分装，-80℃冻存备用。采用ELISA试剂盒根据说明书的指导测量血清中IL-1β、TNF-α的水平。

2.2.3 大鼠膝关节腔灌洗液中NO、PGE-2的含量测定

取血后大鼠膝关节腔内注射1ml生理盐水进行灌洗，将灌洗液在4℃条件下1500r/min离心15min，分离上清后进行分装，-80℃冻存备用。取其上清液按照ELISA试剂盒说明书的要求测定灌洗液中PGE-2的含量，根据说明书的指导采用硝酸盐还原酶法检测灌洗液中总NO含量。

2.2.4 大鼠关节滑膜组织中MMP-1、MMP-13的含量测定

取大鼠膝关节滑膜组织，液氮速冻后转-80℃冻存备用。取适量滑膜组织，加入冰生理盐水，置于冰浴中用组织匀浆器制成2%滑膜组织匀浆，离心取上清液，离心条件4℃下，3500 r/min，10 min。取适量上清液，按照ELISA试剂盒说明书的要求测定滑膜组织上清液中MMP-1、MMP-13含量。

2.3 统计学处理

全部实验数据均采用SPSS 17.0软件进行。根据检验数据资料的正态性和方差齐性，各组数据均用±s表示，组间比较采用t检验比较差异的显著性。P＜0.05即有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠膝关节宽度变化结果

实验结果表明,正常对照组给生理盐水前后膝关节直径无变化（P＞0.05）。与正常对照组相比，各造模组大鼠膝关节直径显著升高（P＜0.01），各造模组之间比较无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，阳性对照双醋瑞因胶囊组、组方优化的阳和胶囊高剂量组的大鼠膝关节直径显著降低（P＜0.01），组方优化的阳和胶囊中、低剂量组的大鼠膝关节直径明显降低 （P＜0.05）。结果见表1。

3.2 大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量测定结果

与正常对照组相比，模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α 含量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，阳性对照组、组方优化的阳和胶囊高剂量组大鼠血清中的IL-1β、TNF-α 含量显著降低（P＜0.01），组方优化的阳和胶囊中、低剂量组的IL-1β、TNF-α含量明显降低（P＜0.05）。 结果见表 2。

3.3 大鼠膝关节灌洗液中NO、PGE-2含量测定结果

与正常对照组相比，模型组大鼠关节灌洗液中NO、PGE-2 含量显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，阳性对照组、组方优化的阳和胶囊高剂量组关节灌洗液中 NO、PGE-2 含量显著降低（P＜0.01），组方优化的阳和胶囊中、低剂量组关节灌洗液中NO、PGE-2含量明显降低（P＜0.05）。 结果见表 2。

3.4 大鼠滑膜组织中MMP-1、MMP-13含量测定结果

与正常对照组相比，模型组大鼠滑膜组织中MMP-1、MMP-13 含量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，阳性对照组、组方优化的阳和胶囊高剂量组滑膜组织中MMP-1、MMP-13含量显著降低 （P＜0.01），组方优化的阳和胶囊中、低剂量组滑膜组织中MMP-1、MMP-13 含量明显降低（P＜0.05）。 结果见表 3。

4 讨论

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨降解为主，伴有滑膜炎症的关节退行性疾病，临床表现为关节僵硬疼痛肿大、慢性渗出性滑膜炎及进行性运动受限。随着我国人口结构老龄化以及肥胖、外伤等病因，罹患骨关节炎已为患者造成一定的经济压力。目前临床常用的非甾体类抗炎药、双醋瑞因及硫酸氨基葡萄糖等只能在短期内缓解关节症状，研制一种标本兼治的骨关节炎治疗药物已成为骨科医学工作者的研究热点。

在骨关节炎的发病过程中，关节软骨MMPs的异常增高是导致关节ECM合成与降解失衡的主要原因，其可导致关节软骨中Ⅱ型胶原、蛋白多糖的过度降解，使软骨破坏[7]。MMP-1研究较多，其表达量随着软骨退变程度加重而逐渐增高，目前已有学者将MMP-1作为一项生物学指标去评价新型软骨保护性药物的性能；MMP-13可直接降解软骨基质中含量最多的Ⅱ型胶原，影响Ⅱ型胶原代谢，间接反映软骨损伤程度。IL-1β是促炎始动因子，一方面可与TNF-α协同促进IL-6、PGE-2等其他炎性细胞因子释放[2]，加剧软骨分解代谢，还可激活iNOS，生成大量NO及ROS介导软骨细胞凋亡；另一方面参与调控MMPs/TIMPs平衡，抑制蛋白聚糖合成，降解Ⅱ型胶原，促进软骨下骨囊变形，引起基质钙化，继而上调MMP-1、MMP-13的表达。滑膜中高含量的NO会使血管扩张、血管壁通透性增加形成关节积液，使关节肿胀疼痛。PGE-2是关节软骨降解中最主要的分解代谢因子之一，具有致炎致痛作用[6]，可与IL-1相互作用增加对软骨的分解，使滑膜细胞与浸润性炎性细胞反应性增强，加重滑膜炎症。炎症因子之间相互作用，共同促进滑膜炎症及炎性渗出引起的关节疼痛肿胀，因此控制炎症、抑制炎症因子的表达是治疗骨关节炎的重要任务。实验结果表明，组方优化的阳和胶囊可降低体液炎症因子的含量，抑制骨关节软骨中基质金属蛋白酶合成，起到抗炎止痛、减轻关节软骨损伤的治疗作用。

综上所述，组方优化的阳和胶囊在缓解碘乙酸钠诱导的大鼠骨关节炎的同时，降低了膝关节腔灌洗液及血清中 IL-1β、TNF-α、NO、PGE-2 的表达， 降低了软骨组织中MMP-1、MMP-13的含量。提示组方优化的阳和胶囊治疗碘乙酸钠诱导的大鼠骨关节炎的机制可能是下调促炎因子的表达及降低软骨组织中基质金属蛋白酶的含量来治疗骨关节炎。关于组方优化的阳和胶囊治疗碘乙酸钠诱导的大鼠骨关节炎的作用机制有待进一步深入研究。