乙醇诱导改性对乳清分离蛋白结构及乳化特性的影响

冯旸旸,王 浩,于 栋,徐敬欣,孔保华,刘 骞

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

乳清蛋白是干酪生产副产物中乳清的主要成分,其主要包含β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、牛血清白蛋白等组分。根据蛋白质浓度的不同可以分为乳清分离蛋白(Whey protein isolate,WPI)和乳清浓缩蛋白(Whey protein concentrate,WPC)[1]。乳清蛋白凭借其营养丰富、消化吸收率高的特点,享有“蛋白之王”的美称,而且经常被作为功能性食品配料或添加成分用于食品工业中[2]。然而,由于β-乳球蛋白的结构缺陷,使得乳清蛋白具有一定的致敏性,极大地限制了其在食品工业中的应用范围。因此,许多研究者尝试采用不同的改性技术处理乳清蛋白,通过改变蛋白质的分子量、电荷分布、表面疏水性、空间结构等理化性质,进一步增强或改善其功能性质[3]。目前,常见的乳清蛋白改性技术主要集中于物理改性、化学改性以及酶改性等方面。其中,热处理、超高压和超声波等物理改性技术主要通过改变乳清蛋白的结构和分子间作用力来达到改善其功能特性的目的[4-6];酰化、磷酸化或糖基化等化学改性技术主要通过修饰乳清蛋白氨基酸残基的侧链基团或促进二硫键的裂解,使表面电荷、空间结构等发生变化,从而达到改善其功能特性的目的[7-9];而酶法改性技术主要利用特异性酶制剂,诱导乳清蛋白分子的交联或水解,从而实现其结构组成和功能特性的改变[10-11]。

近年来,相关研究表明,由于醇类的极性低于水,可以削弱稳定蛋白质结构的疏水相互作用,同时增强静电相互作用,从而促进蛋白质的改性[12-13]。Lambrecht等[14]研究发现,利用50%(v/v)乙醇可以促使牛血清白蛋白分子间发生共价交联,从而导致蛋白分子发生聚集。Peng等[15]研究发现,利用乙醇改性处理大豆β-伴球蛋白,能够显著诱导蛋白分子的聚集和变性,而且其效果具有乙醇浓度依赖性。然而,虽然相关研究已经证实,乙醇能够导致蛋白质分子的聚集或变性,但是关于乙醇诱导改性提高乳清蛋白乳化特性,及其相关机制方面的研究甚少。基于此,本文利用不同浓度的乙醇(10%、30%、50%和70%,v/v)处理WPI,分析探讨乙醇改性处理对WPI的分子结构和乳化特性的影响,并进一步阐明乙醇改性对WPI分子构效的影响机制,以期为改善WPI分子结构以及提高其乳化特性提供新的思路,并奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳清分离蛋白(WPI,蛋白含量90%) 北京银河路商贸有限责任公司;无水乙醇 天津市天力化学试剂有限公司;8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)、考马斯亮蓝R-250 美国Sigma公司;十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基胺基甲烷(Tris) 北京索莱宝生物科技有限公司;盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、磷酸氢二钠 均为分析纯;实验用水 均为去离子水。

AL-104型精密电子天平 梅特勒-托利多仪器设备(上海)有限公司;JD500-2电子天平 郑州南北仪器设备有限公司;HJ-6多头磁力搅拌器 常州丹瑞实验仪器设备有限公司;FE20K型pH计 上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司;TU-1800 紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;F-380型荧光分光光度计 天津港东科技发展股份有限公司;圆二色光谱仪 英国应用光物理公司;T18匀浆机 德国IKA公司;Zetasizer Nano-ZS 型纳米粒度及电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司;5500LS原子力扫描探针显微镜 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 用不同浓度的乙醇溶液(10%、30%、50%和70%,v/v)溶解WPI,同时以蒸馏水溶解的WPI作为对照组,将3%(w/v)溶液置于磁力搅拌器在室温下搅拌4 h。用0.1 mol/L HCl将溶液pH调至7.0后,将蛋白溶液在室温下用电风扇吹2～3 h去除残留的乙醇,然后将各样品冻干得到不同浓度乙醇改性处理的WPI样品。

在测定改性后WPI的结构特性和功能特性之前,首先测定不同样品的水分含量,然后用双蒸水配制成10 mg/mL的溶液,用磁力搅拌器在室温下搅拌2 h使其充分溶解,然后放置于4 ℃冰箱中12 h使其充分水合备用。

1.2.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE) 对不同浓度乙醇改性处理的WPI样品进行还原和非还原电泳实验。将浓度为2 mg/mL的样品溶液与蛋白溶解液(由0.25 mol/L pH=6.8的Tris-HCl,SDS,溴酚蓝以及甘油配制而成)按1∶1比例混合(还原电泳实验再添加10%的β-巯基乙醇),在沸水浴中煮3 min,冷却至室温备用。分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为5%,开始电泳时电压为80 V,待样品进入分离胶后改为120 V;电泳结束后,取出胶片加入染色液染色20 min,之后再用脱色液脱色。

1.2.3 圆二色谱测定 参考Cao等[16]的方法并作适当修改,用双蒸水将样品稀释为0.5 mg/mL的待测溶液,将其注入光径为1 mm的样品池中,用圆二色谱仪进行扫描。以双蒸水为空白,扫描范围为190～250 nm,扫描速度为60 nm/min,累积扫描3次。利用圆二色谱Pro软件分析计算得出样品中各二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲)的含量。

1.2.4 荧光光谱测定 使用荧光分光光度计对样品溶液(1 mg/mL)进行荧光光谱扫描,测定样品中色氨酸(Trp)残基的变化。参数设置为:激发波长295 nm,扫描范围300～400 nm,扫描速度240 nm/min,狭缝宽度10 nm。

1.2.5 紫外吸收光谱测定 用紫外可见分光光度计对样品溶液(1 mg/mL)进行紫外光谱扫描。参数设置为:扫描范围250～340 nm,扫描速率为中速,采样间隔为1.0 nm,光径为1 cm。

1.2.6 原子力显微镜观察 利用原子力显微镜观察样品的微观形貌。用双蒸水将样品稀释为1 mg/mL的蛋白溶液,取样20 μL 滴加在干净的云母片上,室温下干燥后选择轻敲模式进行观察,扫描范围为2 μm×2 μm,使用NanoScope Analysis进行原子力显微镜数据分析。

1.2.7 粒径和电势测定 用纳米粒度及电位分析仪测定不同的WPI样品溶液(1 mg/mL)的粒径和ζ-电势,室温条件下,每个样品测量三次。

1.2.8 表面疏水性测定 利用荧光探针ANS法测定样品的表面疏水性。将每组样品溶液用双蒸水稀释成质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液,吸取每个浓度梯度的蛋白溶液2 mL,分别与20 μL 8 mmol/L的ANS溶液混合,室温条件下暗反应20 min,随后用荧光分光光度计测定荧光强度。测定参数设置为:激发波长390 nm,发射波长470 nm,狭缝5 nm,扫描速度240 nm/min。以蛋白质量浓度(mg/mL)为横坐标,荧光强度为纵坐标,曲线初始段的斜率即代表蛋白的表面疏水性。

1.2.9 乳化特性测定 参考Chen等[17]的方法测定样品的乳化活性(Emulsification activity index,EAI)和乳化稳定性(Emulsification stability index,ESI)。将2 mL菜籽油与8 mL WPI溶液(2 mg/mL)混合,用匀浆机在13500 r/min下匀浆2 min,然后立即从距离管底部0.5 cm处取50 μL新鲜乳状液加入至含5 mL 0.1% SDS溶液的试管中,振荡混匀后在500 nm处测定吸光值记作A0,取均质10 min后的乳状液重复上述步骤记作A10。乳化活性EAI(m2/g)及乳化稳定性ESI(%)由以下公式计算得出:

其中,2为2倍;2.303为换算系数;C为蛋白浓度;φ为乳状液中油相的体积分数(v/v,本实验的油相体积分数为0.2);L为比色皿光径(本实验选用光径为1 cm的比色皿);104为 cm2和 m2单位之间的换算值;D为稀释倍数(本实验的稀释倍数为100);A0、A10分别为乳状液0和10 min时在500 nm处的吸光值。

1.3 数据处理

每个试验重复3次,结果表示为平均数±标准差。数据统计分析采用Statistix 8.1软件包中Linear Models程序进行,差异显著性(P<0.05)分析使用Tukey HSD程序。采用Sigmaplot 12.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE

经不同浓度乙醇改性处理的WPI的非还原型(不添加β-巯基乙醇)和还原型(添加β-巯基乙醇)凝胶电泳图谱如图1所示。从图1中可以看出,未经处理的WPI在分子量14和17 kDa处有明显条带,分别代表α-乳白蛋白和β-乳球蛋白,且由于WPI中含量较高的是β-乳球蛋白,所以β-乳球蛋白条带颜色最深。不同浓度乙醇改性处理后,WPI没有明显的条带消失或生成,说明乙醇改性处理没有改变WPI的蛋白组成。但随着乙醇浓度的增加,蛋白分子发生部分聚集,且在凝胶顶部出现大分子量聚集物,而在还原条件下(添加β-巯基乙醇),大分子或中间分子量复合物发生解离,则说明蛋白分子之间是通过二硫键而形成复合物,Lambrecht等[14]也报道50%(v/v)浓度的乙醇可显著导致BSA间形成二硫化物键,而Nicolai等[18]也表示二硫键在乳清蛋白聚集的形成中起着重要作用。

图1 不同浓度乙醇改性处理后乳清分离蛋白的非还原和还原凝胶电泳图谱

2.2 圆二色谱

二级结构与蛋白质构象的稳定性和功能特性密切相关,圆二色谱已经广泛用于蛋白质二级结构的研究[19]。如图2(a)所示为不同浓度乙醇改性处理过的WPI的圆二色谱图,从图中可以看出,与对照组相比,处理组的峰形没有发生明显变化,均在195和208 nm附近分别出现一个正峰和一个负峰,但处理组的色谱图相比对照组发生下移,说明乙醇改性处理会对WPI的二级结构产生一定影响。此外,波长208 nm附近的负峰代表二级结构中的α-螺旋,处理组的摩尔椭圆率[θ]值较对照组高,说明经乙醇改性处理后WPI的α-螺旋有所增加。

样品各二级结构的具体相对含量可以通过圆二色谱Pro软件分析,分析结果如图2(b)所示,由图可知,对照组的WPI以β-折叠为主,其含量为39.40%,该结果与单杰等[20]用傅里叶红外光谱技术得到的WPI中β-折叠含量达40.67%相接近。与对照组相比,不同浓度乙醇改性处理的WPI二级结构中β-折叠含量均减少,α-螺旋含量均增加,在乙醇改性处理组中,随着乙醇浓度的增加,β-折叠含量呈现先减少后增加的趋势,α-螺旋呈现先增加后减少的趋势,转折点均出现在乙醇浓度为50%的处理组,此时β-折叠和α-螺旋相比对照组分别减少和增加了41.4%和29.4%。类似地,Shiraki等[21]也发现用乙醇改性处理β-乳球蛋白的过程中伴随着β-折叠向α-螺旋的转化,这可能是因为醇类极性低于水,而低极性的溶液环境更有利于分子内氢键的形成,也更容易维持α-螺旋结构的稳定[22]。此外,二级结构中β-转角和无规则卷曲反映的是蛋白质分子的松散程度[23],处理组中β-转角和无规则卷曲含量相比对照组增加,说明一定浓度的乙醇可以使蛋白质结构变得疏松,更有利于改善其乳化性能。

图2 不同浓度乙醇改性处理对乳清分离蛋白的圆二色谱(a)和蛋白二级结构含量(b)的影响

2.3 内源性荧光光谱

蛋白质的内源性荧光光谱可以有效反映其三级结构的构象变化情况。图3所示是不同浓度乙醇改性处理的WPI的内源性荧光图谱,由图可以看出,与对照组相比,各处理组图谱形状均无显著变化,但处理组的荧光强度值均高于对照组,且随着乙醇浓度的增加,WPI荧光强度呈现先增大后降低的趋势,当乙醇浓度为50%时荧光强度达到最大,相比对照组增加了36.90%(P<0.05),内源性荧光强度与蛋白结构中的色氨酸(Trp)密切相关[24],经适当浓度乙醇改性处理可以使WPI结构展开,该结果与二级结构中无规则卷曲的分析结果相吻合。蛋白分子结构展开后,内部Trp残基的暴露导致荧光强度增加,Nor等[25]指出,芳香族氨基酸暴露的增加可以提高蛋白质在油水界面的吸附亲和力,从而有利于改善其乳化特性。但是当乙醇浓度高于50%时,由于部分展开的蛋白质分子之间发生聚合,导致部分发色基团内包于蛋白分子内部进而发生荧光淬灭现象,而且由于蛋白质结构复杂,发色基团暴露在溶剂中也可能导致荧光强度降低[26]。类似的现象在Liu等[27]的研究中也有报道,其发现用10%～40%的乙醇处理大豆β-伴球蛋白可以使其荧光强度增加,但当乙醇浓度继续增加会发生荧光淬灭现象。此外,最大发射波长(λmax)可以作为表示Trp微环境的重要指标[24],处理组与对照组的λmax均大于330 nm,说明Trp残基位于WPI分子外部的极性环境当中[28-29]。当乙醇浓度高于10%时,乙醇改性处理改变了蛋白质中Trp残基所处的微观环境,使其趋向极性更强的环境,因此λmax均显著红移(P<0.05),且乙醇浓度为50%时红移最为显著,由开始的331.40 nm红移至334.27 nm(P<0.05)[15]。

图3 不同浓度乙醇改性处理对乳清分离蛋白的内源性荧光光谱的影响

表1 不同浓度乙醇改性处理对乳清分离蛋白的最大发射波长的影响

2.4 紫外吸收光谱

图4 不同浓度乙醇改性处理对乳清分离蛋白的紫外吸收光谱的影响

蛋白分子中生色基团的分布以及溶液微环境的不同均会影响其紫外吸收光谱。通常,色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)的最大吸收峰在波长275～280 nm处,苯丙氨酸(Phe)的最大吸收峰在波长257 nm处,因此紫外吸收光谱的变化可以反映出蛋白质构象的变化[30]。如图4所示为不同WPI的紫外吸收光谱图,从图中可以看出,对照组在280 nm左右出现最大吸收峰,说明对WPI紫外吸收强度造成影响的是以Trp和Tyr残基为主。与对照组相比,乙醇改性处理没有对WPI的最大吸收峰产生显著影响,但不同乙醇浓度改性处理的WPI最大吸收峰强度均明显高于对照组,且随着乙醇浓度的增加,WPI最大吸收峰强度先增加后降低,乙醇浓度为50%时达到最大,这可能是因为经乙醇改性处理的WPI发生去折叠现象,结构变得疏松,有更多的Trp和Tyr残基暴露出来,使得WPI紫外吸收强度增加,但当乙醇浓度大于50%时,蛋白分子的氨基酸残基发生重组,导致生色基团被包埋在分子内部,紫外吸收强度减弱[31],该结果与内源性荧光光谱分析结果相一致。

表2 不同浓度乙醇改性处理对乳清分离蛋白的最大紫外吸收波长的影响

2.5 微观形貌

利用原子力显微镜可以在空气环境中观察蛋白质的分散和聚集等形态[32]。如图5、表3所示为通过Nanoscope软件分析得到的不同样品的二维图像(图5A)、三维图像(图5B)和Rq值(表3),B图为A图对应的三维图像,Rq表示蛋白的平均粗糙度,通过它们可以对WPI的表面形态进行一定表征。从A图和B图中可以直观地看出:与对照组相比,处理组的表观形态均发生变化,表面平滑度降低,颗粒明显,且乙醇浓度为50%时,粒径更小且分布更为均匀密集,当乙醇浓度高于50%时,蛋白相互聚集蛋白形成了聚集体,明显观察到了大颗粒聚集物。此外,Rq作为微观形貌的量化指标,可以评价蛋白表面形态水平,当乙醇浓度为10%时,处理组的粗糙度增加了15.8%,但与对照组差异不显著(P>0.05),当乙醇浓度大于10%时,由于蛋白结构展开程度增加,处理组的Rq值均显著增加(P<0.05),且乙醇浓度为50%时,Rq值达到最大值0.794 nm,当乙醇浓度大于50%时,Rq开始减小但仍显著高于对照组(P<0.05),根据任晓锋等[33]研究结果可知,蛋白质的表面粗糙增加,则蛋白质的分子表面积增大,可以暴露出更多的功能基团,对于改善其功能特性有积极作用。

图5 不同浓度乙醇改性处理对乳清分离蛋白的微观形貌的影响

表3 不同浓度乙醇改性处理对乳清分离蛋白表面平均粗糙度的影响

2.6 粒径和ζ-电势

蛋白质的聚集程度可以用平均粒径来表示,而蛋白质的ζ-电势可以表征体系的稳定性以及粒子表面带电荷性质,与蛋白质的平均粒径也密切联系。从图6可以看出,处理前后的蛋白分子表面均带负电荷,表明WPI表面所带负电荷多于正电荷,随着乙醇浓度的增加,蛋白结构逐渐展开,有更多的带电基团暴露出来,分子表面所带电荷增加,分子间静电斥力增加,因此蛋白平均粒径减小,当乙醇浓度增加到30%,粒径达到最小,乙醇浓度为50%时,蛋白平均粒径与30%时无显著差异(P>0.05)。但当乙醇浓度继续增加到70%,分子表面带电量减小,静电斥力降低导致蛋白分子相互靠近并发生相互作用生成聚合物,因此平均粒径显著增加(P<0.05)。这种高浓度乙醇条件下发生的聚集可以从蛋白的微观形貌(AFM)中明显观察得到。

图6 不同浓度乙醇改性处理对乳清分离蛋白粒径和ζ-电势的影响

2.7 表面疏水性

蛋白质具有两亲性,其疏水基团通常埋藏在蛋白分子内部,通过改变蛋白分子构象可以使疏水基团暴露,疏水相互作用对于蛋白质的稳定和功能特性至关重要[34]。如表 4所示为不同浓度乙醇改性处理过的WPI表面疏水性的测试结果。从表4中可以看出,与对照组相比,处理组的表面疏水性均显著增加(P<0.05),且随着乙醇浓度的增加,WPI表面疏水性呈现先增加后降低的趋势,当乙醇浓度为50%时处理组的表面疏水性最强,高达8493.00,说明适当浓度的乙醇可以使蛋白质构象改变,蛋白质分子结构展开,埋藏在内部的疏水性氨基酸(如Trp和Tyr)残基暴露,增加了荧光探针(ANS)的结合位点,使得蛋白质疏水性增强,但当乙醇浓度超过50%时,过高的乙醇浓度可能会破坏蛋白的疏水区域,而且蛋白分子表面暴露的疏水基团之间可能通过相互作用形成疏水聚集体,将部分疏水基团掩盖,导致蛋白质的表面疏水性降低。类似地,Kundu等[12]在研究乙醇对球蛋白结构的影响时也发现,在适当浓度乙醇的存在下,蛋白质疏水性相对较高的部分被暴露出来,并指出这可能是由于蛋白质表面周围的电荷密度发生了变化,也可能是由于蛋白分子之间的相互作用发生改变。

表4 不同浓度乙醇改性处理对乳清分离蛋白表面疏水性、EAI和ESI的影响

2.8 乳化特性

蛋白质的乳化特性通常采用EAI和ESI进行表征。EAI指单位质量的蛋白质可以吸附脂肪球的区域面积,ESI表示蛋白质维持油水界面稳定性的能力[35]。从表 4可以看出,各样品之间ESI与EAI趋势一致,处理组的EAI和ESI均显著高于对照组(P<0.05),且随着乙醇浓度的增加,呈现先增加后降低的趋势,转折点出现在50%处,此时EAI和ESI均达到最高,分别为64.48 m2/g和71.10%。结合之前对于蛋白质结构变化的分析可以知道,一定浓度的乙醇可以将WPI结构打开,使暴露的疏水基团数目增加,更多的蛋白分子吸附到油-水界面,更有利于阻止液滴间的相互碰撞和聚集,因此WPI乳化性能有所提高,但当乙醇浓度持续增加时,生成的蛋白聚合物将部分疏水基团掩盖,导致乳化活力降低,而粒径较大的蛋白聚合物可能无法有效地覆盖脂肪滴,导致乳状液不稳定。Peng等[15]研究发现,低浓度乙醇改性处理β-伴球蛋白可以增强其表面疏水性,显著提高其乳化性能和界面稳定性,与本研究结果相一致。

3 结论

本实验主要针对利用不同浓度的乙醇诱导改性是否能够打开WPI分子结构以及改善其乳化特性进行了深入研究。研究结果发现,乙醇改性能够促使分子结构的展开和重排,使WPI分子表面暴露出更多疏水基团并增加分子表面平均粗糙度。同时,高浓度乙醇使WPI分子部分发生变性还会产生蛋白质聚集。基于结构的改变,WPI的EAI和ESI得到了显著的提升,尤其是乙醇浓度为50%时改善效果最为显著。因此,本实验为改善WPI的乳化特性提供了有效的策略。