玉米粉中伏马毒素B1和B2基体参考物质的研制

孟佳佳 郭文博 张志岐 王松雪 聂冬霞 叶 金郭大凯 王 敏 赵志辉 徐剑宏 韩 铮*

（1上海市农业科学院，上海市奉贤区 201403；2国家粮食和物资储备局科学研究院，北京市西城区 100037；3中国农业科学院，北京市海淀区 100081；4江苏省农业科学院，江苏省南京市 210014）

伏马毒素主要是由串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）、轮状镰刀菌（Fusarium verticilllioides）等在一定温湿度条件下产生的次级代谢产物。迄今为止，已发现几十种伏马毒素，其中最重要的是伏马毒素B1（Fumonisin B1，以下简称为FB1）和伏马毒素B2（Fumonisin B2，以下简称为FB2）[1]，其具有神经毒性、免疫毒性、器官和组织毒性、生殖毒性、致癌性等，且国际癌症研究中心把伏马毒素列为2B级致癌物[2-3]。

目前，伏马毒素的主要检测方法为酶联免疫法、液相色谱串联质谱法、衍生化后液相色谱荧光检测等，但不同实验室甚至同一实验室采用不同的检测方法，对同一样品的分析结果之间存在明显差异，量值很难统一，难以确保不同实验室检测结果的可比性[4]。同时，基体参考物质是具有高度均匀性、良好稳定性和量值准确性的一种计量标准，有利于克服由于基体效应所引起的误差，从而保证检测结果的准确性和量值的可溯源性，且其可用于校准仪器、验证检测方法及实验室的质量控制等[5]。此外，由于FB1和FB2的标准品溶液与被FB1和FB2污染的小麦和玉米样品之间存在较大的差异，其进入人和动物体内的生理活性、生物转化路径及毒性强弱均不一致，从而导致其代谢、毒理研究结果的不可靠，而基体参考物质在性质上、基体组成上与实际样品一致。因此，采用基体参考物质替代纯真菌毒素标准品溶液进行此方面的研究更具有应用价值及指导意义。但是，目前国内尚未有FB1和FB2基体参考物质及其制备方法的报道。在此背景下，本研究拟以相关国家标准以及ISO导则[6-10]为指导，研制玉米粉中FB1和FB2的基体参考物质，以期能对玉米粉中伏马毒素的检测、毒理代谢等研究起到促进作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Waters超高效液相色谱仪、串联三重四级杆质谱仪Warters TQS（美国Warters公司），Heraeus Multifuge X3高速离心机、Thermo Scientific Heraguard ECO 超净台（美国Thermo Fisher scientific公司），霉菌培养箱（上海精宏实验设备有限公司），SX-500高压灭菌锅（日本TOMY公司），水浴氮吹仪（青岛路博环保仪器公司），DWH三维混合机（上海德越粉体机械有限公司）。

PDA粉末（北京陆桥技术有限责任公司），甲醇、乙腈（美国Merck公司，色谱纯），醋酸铵（美国Aladdin公司，色谱纯），FB1标准品（50μg/mL）和FB2标准品（50 μg/mL）（Sigma-Aldrich公司，St. Louis，MO，USA)。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：称取40.0 g PDA粉末于1 L蒸馏水中，121 ℃高压灭菌20 min备用。

玉米培养基：称取50 g玉米粉至 250 mL三角瓶，加入20 mL蒸馏水混匀，用透气封口膜密封瓶口，浸泡过夜，高压灭菌（121 ℃，20 min），冷却后将玉米粉摇散待用。

玉米粉（经检测不含FB1和FB2）购于上海大型超市，串珠镰刀菌由上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所提供。

1.2 分析方法

1.2.1 样品前处理

准确称取2.00±0.01 g待检样品，置于50 mL离心管中，加入10.0 mL乙腈-水溶液（50/50，v/v）作为提取剂，涡旋混合30 s，浸泡5 min，超声提取1 h，4 000 r/min离心10 min。取上清液过0.22 μm滤膜，用甲醇-水溶液（20/80，v/v）稀释10 000倍后，采用超高液相色谱-质谱联用技术 (UPLC-MS/MS）进行检测。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18（100 mm × 3.0 mm，2.7 μm）（Agilent，CA，USA）。

流动相：A相为甲醇溶液；B相为5 mmol/L醋酸铵水溶液。

梯度洗脱：0～0.5 min，10%A；6 min，90%A；6.5 min，90%A；6.7 min，10%A；8 min，10%A；流速为0.4 mL/min；进样量3 μL；柱温40 ℃。

1.2.3 质谱条件

采用电喷雾正离子扫描模式（ESI+），脱溶剂气、锥孔气均为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气，脱溶剂温度为500 ℃，离子源温度为150 ℃，锥孔气流和脱溶剂气流分别是7.0 L/h和1 000 L/h，通过多反应监测（MRM）模式对目标化合物准确定量，FB1和FB2的母离子、子离子、碰撞能量等参数见表1。

表1 FB1和FB2的质谱条件参数

1.3 参考物质的制备

1.3.1 菌株的活化

将串珠镰刀菌菌株接种在PDA培养基上，28℃黑暗条件下培养5 d，备用。

1.3.2 菌株的发酵培养

用无菌打孔器在菌落上取直径为0.5 cm的菌丝块，将菌丝块接种至玉米培养基中，用无菌透气封口膜密封，置于28 ℃黑暗条件下培养4周。接种第1周，每天振荡三角瓶1次，使菌丝与培养基充分接触。

1.3.3 基体参考物质制备

培养结束后，将锥形瓶中的产毒培养基取出置于烘箱50 ℃烘干，打碎成粉末过60目筛后，将含有高浓度FB1和FB2的玉米培养基粉末封存在自封袋中待用。称取上述制备得到的含有高浓度FB1和FB2的玉米培养基粉末，与空白玉米粉（经检测无FB1和FB2）均匀混合，逐级稀释，制备获得玉米粉中FB1和FB2基体参考物质。选用铝箔袋，将制备好的玉米粉中FB1和FB2基体参考物质抽真空分装，每个包装50 g，密封100个包装，置于-20 ℃保存。

1.4 均匀性检验

按照JJG 1006-1994[6]和JJF 1343-2012[7]的相关规定，从制备获得的FB1和FB2基体参考物质中随机取样15个包装单元，每个包装单元中取样2.00 g（最小取样量为2.00 g），重复取样3次，采用UPLC-MS/MS法平行测定3次，测定结果采用方差分析法（经F检验），统计检验参考物质的均匀性。

1.5 稳定性监测

根据JJG 1006-1994和JJF 1343-2012的要求，将样品置于4 ℃恒温箱中保存，模拟运输条件以考察参考物质的短期稳定性。分别在第0、2、4、6、8天进行短期稳定性监测，每次抽取3个包装单元，每个包装平行测3次。

参考物质长期稳定性考察按照先密后疏的原则，在第0、1、3、6、12个月进行-20 ℃储存条件下长期稳定性考察。

1.6 参考物质的定值和不确定度评估

参考物质的定值采用多家实验室联合定值、数据汇总统计的方式。参加联合定值的6家实验室均具有相应的检测资质，并具有FB1和FB2标准物质定值的条件，各家实验室在分析过程中进行严格的质量控制，采用UPLC-MS/MS法对制备的参考物质进行定值。对6家实验室提供的数据，用狄克逊（Dixon）法检验实验室间数据是否有离群值，随后采用科克伦（Cochran）法检验数据的精度为等精度后，最后计算出总平均值和标准偏差。

玉米粉中FB1和FB2基体参考物质的不确定度主要由参考物质的不均匀引入的不确定度（ubb）、参考物质的不稳定引入的不确定度（usts）、参考物质定值引入的不确定度（uA）三部分组成。

2 结果与分析

2.1 均匀性检验

采用单因素方差分析法进行组内和组间均匀性检验。由表2可知，F＜F0.05（14,30），表明玉米粉中FB1和FB2基体参考物质均匀性良好，符合标准物质技术规范要求。

表2 玉米粉中FB1和FB2基体参考物质的均匀性

2.2 稳定性检测

2.2.1 短期稳定性考察

由表3可知，经直线拟合法对短期稳定性监测数据进行检验，可见｜b1｜

2.2.2 长期稳定性考察

由表4可知，经直线拟合法对长期稳定性监测数据进行检验，可见｜b1｜

2.3 定 值

6家实验室的玉米粉中FB1和FB2基体参考物质定值结果见表5。将所有实验室的数据汇总分析，每个实验室的组内数据经狄克逊准则检验是否有异常值，各实验室的定值数据采用科克伦准则判断数据是否等精度，最终6家实验室的数据均被采用。因此，本参考物质的定值结果为6家实验室测定结果的总平均值，即FB1的含量为1.07 mg/kg，FB2的含量为0.43 mg/kg。

表3 玉米粉中FB1和FB2基体参考物质的短期稳定性检测结果

表4 玉米粉中FB1和FB2基体参考物质的长期稳定性检测结果

2.4 不确定度评估

2.4.1 均匀性引入的不确定度

FB1均匀性引入的不确定度：

FB2均匀性引入的不确定度：ubb=0.008 2 mg/kg。

2.4.2 稳定性引入的不确定度

FB1短期稳定性引入的不确定度：usts=s(b1)·t=0.003 9×8=0.031 2 mg/kg。

FB1长期稳定性引入的不确定度：ults=0.0271mg/kg。

FB2短期稳定性引入的不确定度：usts=0.0230mg/kg。

FB2长期稳定性引入的不确定度：ults=0.0235mg/kg。

表5 玉米粉中FB1和FB2基体参考物质定值结果 （单位：mg/kg）

2.4.3 定值引入的不确定度

本参考物质的定值采用6家实验室联合定值的方法，经狄克逊和科克伦检验，6家实验室的平均值为合作定值结果，将这6组实验室的平均值作为一组新的数据，计算定值引入的不确定度。

FB1定值引入的不确定度：

FB2定值引入的不确定度：

2.4.4 合成标准不确定度

FB1的合成标准不确定度：

FB2的合成标准不确定度：

2.4.5 扩展不确定度

FB1的扩展标准不确定度：U=k·uCRM=2×0.043 0≈0.09 mg/kg (k=2)。

FB2的扩展标准不确定度：U=k·uCRM=2×0.034 3≈0.07 mg/kg (k=2)。

2.5 定值结果

玉米粉中伏马毒素B1和B2基体参考物质中FB1的含量为1.07 ±0.09 mg/kg，FB2的含量为0.43±0.07 mg/kg。

3 结 论

本研究通过将产毒菌株接种于玉米培养基，在最佳条件下培养，从而得到含大量FB1和FB2的基质样本，将其打碎成粉末并过筛，与空白玉米粉等比例稀释摇匀，获得了玉米粉中FB1和FB2基体参考物质。组织6家实验室利用UPLC-MS/MS法进行了联合定值，考察了其均匀性和稳定性，并对研制过程中产生的不确定度进行了系统评估。结果表明，该基体参考物质均匀性良好，且满足12个月以上的稳定性要求，最终得到玉米粉中FB1和FB2基体参考物质的量值分别为1.07±0.09 mg/kg和0.43±0.07 mg/kg。因此，该参考物质可用于玉米粉中FB1和FB2的定性和定量检测、FB1和FB2检测方法的评价及其代谢毒理学研究等。本研究为国家农产品质量安全风险评估与监测溯源体系的建立，提供了一定的技术支持与物质保障。