重组禽流感H5+H7亚型三价灭活苗(H5N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2株)的免疫效果探究

章天霞

（桐城市畜牧兽医管理中心，安徽省安庆市 231400）

禽流感是禽流行性感冒的简称，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，是由A型流感病毒引起的一种禽类传染病。禽流感病毒（AIV）属于RNA病毒的正黏病毒科，H5N1禽流感病毒为高致病性亚型，具有血凝素第5型、神经氨酸酶第1型，可以感染人。其中，自2003年以来，H5N1导致了数百万家禽感染，且其传播迅速、病程短、死亡率高；H7N9是一种新型禽流感，2013年3月底在上海和安徽被发现，严重危害人类身体健康[1]。目前，这些高致病性禽流感给养禽业造成了巨大的经济损失，已被农业农村部纳入强制免疫监测动物疫病范畴。同时，实践表明，重组禽流感灭活苗具有使用安全、不会导致病毒扩散，可在常温贮存和运输、防疫期间无需携带冷藏设备，受母源抗体的影响少，产生抗体水平高，免疫效果与单价相似或更佳，减少接种次数及疫苗运输、存放成本等优势。

在此背景下，为探究重组禽流感H5+H7亚型三价灭活苗（H5N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2株）的免疫效果，减少禽流感的发生与传播，笔者采用血凝和血凝抑制试验，分别对2019年、2020年春防集中免疫鸡血清样品进行了禽流感病毒H5N1Re-11株、Re-12+H7N9Re-2株抗体水平的检测，并对两次试验结果进行了综合分析。现将相关试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试试剂

供试试剂为肇庆大华农生物药品有限公司重组禽流感H5+H7亚型三价灭活苗（H5N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2株）。

抗体检测试剂为禽流感H5(Re-11)、H5(Re-12)血凝抑制试验抗原（批号分别为20191012和20190828），禽流感H5(Re-11)、H5(Re-12)血凝抑制试验阳性血清（批号分别为2 0 1 9 1 0 1 1和20190824），禽流感H7(Re-2)血凝抑制试验抗原（批号为20190923），禽流感H7(Re-2)血凝抑制试验阳性血清（批号为20190425），生产厂家均为哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

1.2 免疫剂量及方法

2019年、2020年免疫鸡在15～45日龄的，免疫剂量为0.3 mL/羽，颈部皮下注射；在45日龄以上的，免疫剂量为0.5 mL/羽，肌肉注射。

1.3 鸡血清样品来源

检测鸡血清样品来自桐城市所辖的14个乡镇。于各乡镇（村）散养户、规模养殖场分别随机采集5～10份鸡血清样品[2]，2019年春防共计采集160份鸡血清样品，2020年春防共计采集215份鸡血清样品。

采样时间均为集中免疫重组禽流感H5+H7亚型三价灭活苗后20～30 d。

1.4 检测方法

根据《GB/T 18936-2003 高致病性禽流感诊断技术》规定的血凝与血凝抑制试验方法进行操作[3]。

具体步骤：（1）采集3只SPF公鸡（或体内无禽流感和新城疫抗体的公鸡）的血液，与等体积3.8%枸橼酸钠混合，离心后弃上清液，沉淀物中加生理盐水洗涤3次，最后配成体积百分比为1%鸡红细胞悬液，4 ℃保存备用。（2）4单位抗原的配制。（3）血凝抑制（HI）试验（微量法）。在微量反应板的第1～11孔加入生理盐水25 μL，第12孔加入生理盐水50 μL；吸取血清25 μL加入第1孔，充分混匀后吸25μL于第2孔依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25 μL弃去；第1～11孔均加入含4 HAU混匀的病毒抗原液25μL，微量振荡30 s，室温（约20 ℃）静置至少30 min；每孔加入25 μL体积百分比为1%的鸡红细胞悬液混匀，微量振荡30 s，静置30 min（室温约20 ℃，若环境温度太高则置于4 ℃条件下进行）。（4）结果判定。对照红细胞将呈现点状沉于孔底，倾斜70°后，以流淌呈线状的孔数为血凝抑制效价，记作2n；以完全抑制4单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI的滴度；待检血清HI效价≥4 log2时，判定为抗体合格。

2 结果与分析

由表1可知，2019年春防集中检测鸡血清样品共160份，其中，H5免疫抗体合格率为86.25%，H7免疫抗体合格率为83.75%，H5+H7同为阳性的占76.25%。

表1 2019年集中检测H5、H7免疫抗体情况 (单位：份)

由表2可知，2020年春防集中检测鸡血清样品共215份，其中H5免疫抗体合格率为87.91%，H7免疫抗体合格率为87.44%，H5+H7同为阳性的占85.58%。

综上，经重组禽流感三价灭活苗接种后，家禽体内产生H5免疫抗体的平均合格率为87.08%，产生H7免疫抗体的平均合格率为85.60%，均达到农业农村部对高致病性禽流感防疫的总体要求（存栏家禽的有效免疫抗体合格率达7 0%以上）。同时，H5+H7同为阳性的平均符合率为80.92%，表明经重组禽流感三价灭活苗接种后，大部分家禽机体内能同时产生H5、H7免疫抗体，且基本无相互拮抗现象。

表2 2020年集中检测H5、H7免疫抗体情况 (单位：份)

3 结论与讨论

试验结果表明，重组禽流感H5+H7亚型三价灭活苗（H5N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2株）的免疫效果良好，大多数家禽能产生较强的保护抗体[4]，可以推广应用。

同时，经分析，免疫失败的原因可能为：（1）免疫程序不合理；（2）家禽自身存在某些免疫抑制性疾病或其他能导致免疫力下降的疾病；（3）家禽的品种差异，有的个体甚至有先天缺陷；（4）接种疫苗时存在应激反应；（5）免疫次数和采样时间不同；（6）疫苗注射剂量不够或过高；（7）疫苗稀释错误、稀释后未及时使用；（8）接种前后使用了免疫抑制性药物等。