RT-PCR技术检测猪瘟病毒应用浅析

陈隆全

（重庆市綦江区东溪镇畜牧兽医站 401434）

猪瘟是由猪瘟病毒引发的接触性传染病，病死率高，传染速度快，一旦大范围传播，必然给养殖户造成巨大经济损失，威胁我国养殖行业的发展。由于猪瘟病毒临床表现朝向非典型发展，在临床诊断病猪时受到多种因素感染，很难快速准确地提供诊断结果，延误早期隔离，增加了猪瘟传播的风险。

1 材料和方法

由重庆市动物疫病防控中心提供猪瘟病毒阳性对照材料，将病死猪扁桃体和淋巴结进行取样备用。准备RT-PCR 试剂盒、RNA 试剂盒。

2 设计合成引物

使用RT-PCR 合成特异性引物，设计扩增片段为682bp。

3 制备样品

对病死猪进行剖检，在无菌环境下采集扁桃体和淋巴结，研磨后添加生理盐水进行稀释处理。设定5000r/s 经过5min 离心处理，取上层清液为样品。

4 提取病毒基因组总RNA

按照试剂盒说明，取 100μL 上层清液，添加至 1.5mlEP 管中，加入 SolutionR1 100μL。混合后振荡 30s，放在室温环境中静置 60s。经过处理后，添加 SolutionR2 600μL，经过充分混合颠倒后，在室温环境下静置3～5min。添加上层清液后套离心管，再次进行30s 离心处理。将外套管内部液体倒出，添加Wash Buffer 600μL，经过 30s 离心处理后，将接液管内部液体倒出，要进行两次洗涤处理。将空柱放在10000r/min 离心处理，1min 后转移至新离心管中。在新离心管中转入Spin column，膜中央添加 20～50μL Elution Buffer，在室温环境中静置60s，经过 30s 离心处理后，可以得到 RNA，可以在-70℃下保存或者直接扩增处理。

5 扩增处理

将总 RNA 为模板扩增，取 0.4μL 上下游引物，设定 45℃，经过 30min 反转录后，升高至 94℃进行 5min 预变。在 94℃下经过 30s 变性，设定 52℃进行 45s 退火。在 72℃下进行 45s 的延伸，重复35 个循环。在72℃下进行10min 延伸。

6 荧光定量扩增

以总 RNA 为模板扩增，取 0.4μL 上下游引物，0.4μL 探针 ，0.4μL Passive Reference Dye，1μLRNA 模 板 。并 使 用RNase-free Water，添加至 20μL。设定扩增程序，设定 45℃，经过 25min 反转录后，升高至 95℃进行 2min 预变[1]。在 95℃下经过 10s 变性，设定 55℃进行 30s 退火。在 72℃下进行 30s的延伸，重复 5 个循环。在 95℃下进行 10s 变性，在 55℃下进行30s 退火，经过40 个循环，结束后对荧光进行收集。

7 检测结果

7.1 判定标准

检测Ct 值不超过35，扩增曲线表现出明显指数增长期，可以判断样本为阳性。若Ct 值处于35～40 之间，需要进行重复检验，Ct 值仍然处于这一范围，扩增曲线出现指数增长期，可以判断为阳性，否则样本为阴性。若没有检测到Ct 值，或者样本Ct 值超过了40，可以判断样本为阴性。

7.2 扩增结果

提取样本总RNA 进行RT-PCR 扩增处理，使用1%琼脂糖凝胶对产物电泳，对照阳性片段。在682bp 附近，样品有带则可以确定样本为猪瘟病毒阳性。

7.3 荧光定量扩增结果

应用荧光定量RT-PCR 方法检测猪瘟病毒，检测结果为阳性。和RT-PCR 一致，代表病猪已感染猪瘟病毒。

8 讨论

早期诊断对控制猪瘟的扩散十分关键，需要根据病猪发病情况，及早采取先进技术，诊断猪瘟，才能有效控制猪瘟，避免猪瘟蔓延。PCR 技术得到深入研究，逐渐在动物疫病检测中得到广泛应用，同时可以取代传统血清学和病原分离鉴定方法[2]。检测试验通过借鉴成熟检测技术，在兽医诊断中得到广泛应用，有效减少检测时间，让检测结果特异性和精准性得到显著提高，降低猪瘟给养殖行业造成的经济损失。RT-PCR 技术的应用显著提高了检测效率，规避样本污染及假阳性结果的问题。借助于荧光定量PCT 检测的高特异性和高灵敏性，让猪瘟病原体检测快捷准确。

9 结语

综上所述，使用RT-PCR 检测技术检测猪瘟病毒，可快速灵敏的完成猪瘟检测，指导病猪临床诊断，提高诊断效率。快速获得诊断结果后，能将猪瘟病猪快速隔离，采取科学合理的防治手段，避免猪瘟病毒的传播，减少养殖户经济损失。