老坛水发酵与接种发酵过程中细菌菌落与挥发性成分差异研究

李雨萌，曾里，吴正云

(四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065)

1 概述

四川泡菜是我国传统特色发酵食品的典型代表之一。我国泡菜以自然发酵为主，即利用依附在蔬菜本表面的微生物，加入食盐水进行发酵制成的产品，泡菜发酵口感爽脆、风味独特。已有研究表明[1-3]，老坛水发酵和接种发酵泡菜的品质皆优于自然发酵，但目前国内泡菜行业仍多采用自然发酵(二轮盐渍工艺)[4]。云琳等对不同发酵方式萝卜泡菜的品质差异进行了 研究，研究表明老坛水发酵和接种发酵泡菜中的风味物质皆比自然发酵中丰富，接种发酵与老坛水泡菜间挥发性物质存在差异的原因和机理仍待探究。故本研究采用老坛水和接种菌剂两种方法发酵豇豆，监测发酵过程中细菌群落和挥发性物质的变化，分析发酵液中细菌群落组成与挥发性物质的差异性，进一步从微生物角度探究两种发酵方式挥发性物质差异性的原因，旨在为接种泡菜工业化发展提供一定的理论支持和参考。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验样品与试剂

老坛水：取自发酵时间1年左右的老坛水；豇豆：购于郭家桥农贸市场。用郭家桥农贸市场购买的土陶罐泡制。每种方法设置3个平行样本。

2.1.2 实验仪器

SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵 上海邦西仪器科技有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 北京科伟永兴仪器有限公司；气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；固相微萃取头、固相微萃取进样手柄 西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；E.Z.N.A.水样DNA提取试剂盒 美国Omega公司；ABI GeneAmp 9700型PCR仪 美国ABI公司；MISEQ测序仪 美国Illumina公司。

2.2 实验方法

2.2.1 发酵工艺

老坛水发酵：豇豆用无菌水清洗3遍，加入40 g/L老坛泡菜水，装坛密封发酵。

接种发酵泡菜的制备：植物乳杆菌和肠膜明串珠菌等比例接种[5]，接种比例为0.5%，其他工艺同老坛水发酵。

检测样的制备：豇豆和泡菜液按质量1∶1混合均浆。

2.2.2 泡菜样品挥发性成分的固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)分析

固相微萃取(SPME)条件：取5 g泡菜样品加入顶空瓶中，在50 ℃水浴条件下平衡15 min。然后插入萃取针，在泡菜样品上空萃取20 min,然后拔出萃取针并插入GC-MS进样口中，热解吸5 min进行分析。

气相色谱(GC)条件：色谱柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。GC程序(总程序时间55 min)：初温40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升温至100 ℃；然后以3 ℃/min升温至175 ℃；最后以10 ℃/min升温至215 ℃，保持10 min，不分流，进样口温度250 ℃。

质谱(MS)条件：电子轰击离子源(EI)，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，质谱扫描范围(m/z)：35.00～400.00。

2.2.3 微生物群落检测

利用E.Z.N.A.®水样DNA提取试剂盒进行细菌群落总DNA抽提。对16S rRNA进行扩增，扩增程序：95 ℃预变性3 min，27个循环(95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s)，然后以72 ℃稳定延伸10 min，最后在4 ℃进行保存。PCR反应体系：5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol/L)0.8 μL，下游引物(5 μmol/L) 0.8 μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng。扩增后进行PCR产物的回收、定量。根据 Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 300的文库。

3 结果与讨论

3.1 老坛水、接种泡豇豆发酵过程中的细菌群落结构

研究发现[6-7]，泡菜发酵阶段与风味物质相关的重要微生物主要是细菌群落，故本文主要对细菌群落进行研究。

两种豇豆泡菜在0～15 d发酵周期的细菌群落的变化情况见图1和图2。

图1 老坛水和接种发酵豇豆泡菜细菌门水平群落结构组成Fig.1 The community structure composition in the phylum level of bacteria in laotan water fermented and inoculation fermented cowpea pickles

图2 老坛水和接种发酵豇豆泡菜细菌属水平群落结构组成Fig.2 The community structure composition in the genus level of bacteria in laotan water fermented and inoculation fermented cowpea pickles

在门水平上，老坛水泡豇豆中的主要细菌门类是厚壁菌门(Firmicutes)、Epsilonbacteraeota和变形菌门(Proteobacteria),另有少量放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、哈拉厌氧菌门(Halanaerobiaeota)和蓝细菌门(Cyanobacteria)。接种泡豇豆中的主要细菌门类是厚壁菌门(Firmicutes)，其他门类相对丰度甚微。属水平上，接种发酵豇豆中细菌群落丰度远不如老坛水发酵豇豆。老坛水泡豇豆中优势菌属是乳杆菌属(Lactobacillus)、弓形杆菌属(Arcobacter)、片球菌属(Pediococcus)及嗜盐单胞菌属(Halomonas)。接种泡豇豆中优势菌属是乳杆菌属(Lactobacillus)和盐厌氧菌属(Halanaerobium)，少量嗜盐单胞菌属(Halomonas)。接种泡豇豆发酵过程中，由于接种的乳酸菌和肠膜明串珠菌皆属于乳杆菌属，故发酵初始乳酸菌属相对丰度高，加上发酵过程产酸，抑制了其他菌的生长，保持了乳酸菌的优势地位，发酵后期相对丰度接近98%。老坛水泡菜发酵过程中乳酸菌属相对丰度先上升后下降，原因是随着发酵的进行乳酸菌产酸杂菌,生长受到抑制，乳酸菌属的相对丰度上升。而乳酸菌非绝对优势菌群，因此当发酵后期酸度降到一定值时，乳酸菌自身生长受到抑制，其他菌种开始慢慢增长。

3.2 老坛水、接种发酵豇豆泡菜发酵过程中挥发性成分分析

续 表

图3 老坛水豇豆泡菜发酵过程中挥发性成分相对含量的变化Fig.3 The change in relative content of volatile components in the fermentation process of laotan water fermented cowpea pickles

图4 接种豇豆泡菜发酵过程中挥发性成分相对含量的变化Fig.4 The change in relative content of volatile components in the fermentation process of inoculation fermented cowpea pickles

泡菜的发酵过程主要为乳酸菌的乳酸发酵，发酵前期主要进行异型乳酸发酵，产生醇类、醛类、有机酸；发酵后期主要进行同型乳酸发酵，产生乳酸。发酵过程除产生大量乳酸外，还会形成乙酸、丙酸等有机酸和异戊醇、丁醇等醇类物质。随着发酵进行这些有机酸又会与醇类反应生成乙酸乙酯、乳酸异戊酯等酯类挥发性成分[8]。由表1可知，在老坛水泡豇豆中检测出的挥发性风味成分约有41种，其中有15种为老坛水泡豇豆独有。老坛水泡豇豆含量较高的挥发性物质是酯类、醇类和酸类，以酯类为主。在接种泡豇豆中检测出的挥发性风味成分约有36种，其中11种为接种泡豇豆独有。接种泡豇豆含量较高的挥发性物质是醇类、酯类、酸类及含硫化合物。老坛水泡豇豆的醇类和酯类的种类和相对含量皆高于接种泡豇豆。由图3和图4可知，两种发酵方式的主要风味成分酯类、酸类物质都呈先上升后下降的趋势，醇类物质的相对含量变化不大。接种泡豇豆发酵过程中含硫化合物从发酵第9天开始检出，且相对含量迅速增加。

与现有萝卜等研究结果不同[9-10]，由于豇豆本身酯类化合物含量高[11]，故酯类物质虽然本身阈值较大，仍对泡豇豆风味有积极影响。老坛水泡豇豆酯类相对含量明显高于接种发酵，说明老坛发酵更能保留豇豆本身风味。醇类物质在整个发酵周期相对含量较稳定。醇类物质一部分是原料本身具有的，另一部分则是微生物发酵产生的；此外，醇类物质还能与有机酸反应生成酯类物质，为泡菜的香气做出一定的贡献。在醇类物质中，大部分对豇豆泡菜的风味有积极影响，如α-松油醇具有紫丁香气味，芳樟醇具有花香味，1-辛烯-3-醇有菜豆香[12]。异戊醇还具有烘托酯香的作用，能够使香味更丰腴。但也存在给泡菜带来不良风味的醇类物质，如3-甲基-1-丁醇，有辛辣而令人厌恶的不愉快气味。异戊醇、芳樟醇及α-松油醇等对风味有积极影响的醇类物质含量在老坛水泡豇豆中更高，而产生不愉快气味的3-甲基-1-丁醇则在接种泡豇豆中含量更高，且老坛水泡豇豆总醇相对含量明显高于接种发酵泡豇豆。酸类物质含量较高时，对豇豆泡菜良好风味的形成有一定的积极作用。如含量最多的乙酸，一方面可以降低泡菜的pH值，促进泡菜的成熟，另一方面可以为泡菜增加柔和的酸味。酸类在泡菜的发酵过程中呈增长的趋势，原因是在发酵过程中对异型乳酸发酵的菌株进行代谢的产物有一部分是乙酸。老坛水泡豇豆酸类物质和醇类含量大多高于接种泡豇豆，二者间发生反应生成的酯类物质也就更加丰富，对后期泡菜良好香味有积极作用。

其他物质方面，醛类物质的阈值低，虽含量不多，但对豇豆泡菜的风味有一定的影响。壬醛能赋予泡菜清香味，而糠醛、苯甲醛、3-甲氧基-丙醛则会给豇豆泡菜带来刺激性气味。老坛水泡豇豆中壬醛含量稳定，且刺激性醛类随着发酵的进行而降低或消失，接种泡豇豆中刺激性醛类则随着发酵时长的增加而增加。泡菜中的胺类物质是不良气味的主要来源。接种泡菜中出现的胺类物质会影响泡菜的气味。而含硫化合物的香味阈值极低，低浓度时呈现令人愉悦的香味的含硫化合物在高浓度时都具有强烈的令人厌恶的气味。豇豆不属于十字花科，本身不含硫[13]，而是中后期由于微生物发酵的作用产生的。两种泡豇豆的含硫化合物均从第9天开始检出，后期呈现上升趋势。对比发现，老坛水泡豇豆含硫化合物的相对含量较低，对泡菜风味有积极作用。接种泡菜在发酵后期含硫化合物的相对含量增幅巨大，反而会带来不良气味，故在接种发酵过程中应该严格控制发酵时长。

4 关联性分析

为了更好地揭示泡菜中挥发性组分与细菌群落之间的相互关系，采用冗余分析(RDA)方法，将泡菜样品中的细菌群落特征作为物种，泡菜中特征挥发性组分作为环境因素，对两个样本进行RDA分析[14-15]，见图5。

图5 老坛水和接种发酵豇豆泡菜细菌群落 与挥发性成分RDA分析Fig.5 The RDA analysis of bacterial community and volatile components in laotan water fermented and inoculation fermented cowpea pickles

由图5可知，与老坛水泡豇豆细菌群落相关性最大的挥发性成分是酯类和醇类，其次为酸类、酚类；与接种泡菜细菌群落相关性最大的挥发性成分是含硫化合物，其次是胺类。且两种方式发酵的豇豆都呈现发酵前期微生物群落与醇类、酯类、酸类相关性较大，发酵后期细菌群落与醛类、含硫化合物、胺类相关性更大的特征，这与泡菜发酵前期主要进行异型乳酸发酵而后期主要进行同型乳酸发酵的特点相符。对在两种泡豇豆中相对丰度排名前三的物种与挥发性物质相关性进行分析可知，乳杆菌属(Lactobacillus)对挥发性风味成分的形成几乎没有影响，而弓形杆菌属(Arcobacter)、片球菌属(Pediococcus)对酯类、醇类、酸类、酚类挥发性物质的形成有影响，老坛水泡菜由于细菌群落丰富，对多种挥发性成分形成有利。而接种泡菜中乳杆菌属在初始发酵时相对丰度达到93%左右，对接种泡菜挥发性成分的形成不利。

5 结论

本实验通过对接种泡豇豆和老坛水泡豇豆发酵过程中的细菌群落和挥发性物质进行监测分析，探究发酵液中菌群组成和挥发性物质的差异性，并从微生物角度探究了挥发性物质存在差异性的原因。

采用PCR技术对从发酵液中提取的细菌群落进行扩增、分析，检测出老坛水泡豇豆中细菌群落的丰富度明显高于接种泡豇豆。老坛水泡豇豆在发酵过程中，主要细菌门类是厚壁菌门(Firmicutes)、Epsilonbacteraeota和变形菌门(Proteobacteria)，优势菌属是乳杆菌属(Lactobacillus)、弓形杆菌属(Arcobacter)、片球菌属(Pediococcus)及嗜盐单胞菌属(Halomonas)。接种泡豇豆在发酵过程中，菌种的相对单一，主要细菌门类是厚壁菌门(Firmicutes)，优势菌属是乳杆菌属(Lactobacillus)和盐厌氧菌属(Halanaerobium)，少量嗜盐单胞菌属(Halomonas)。接种泡菜发酵过程中细菌群落结构更加稳定，也更容易实现工业化生产中品质的把控；老坛水泡菜发酵过程中细菌群落的组成变化较大，较难管控。

采用SPME-GC-MS联用法对泡菜发酵过程中的挥发性物质进行分析，检测出老坛水泡豇豆中挥发性成分约有41种，接种泡豇豆中检测出的挥发性风味成分有36种，其中15种为老坛水泡豇豆独有，11种为接种泡豇豆独有。对泡菜风味有积极贡献的醛类、酚类、酯类物质在老坛水泡豇豆中较多，而产生不愉快气味的胺类物质和丰度高时产生不良风味的含硫化合物在接种泡豇豆中含量较高。接种发酵后期产生大量含硫化合物严重影响豇豆泡菜风味，证明接种泡菜发酵时间对风味影响相对较大，指导工业使用接种发酵时应该严格把控发酵时长，避免含硫化合物和胺类的大量产生。

通过对细菌群落和挥发性成分的RDA分析可知，酯类、醇类、酸类、酚类挥发性物质与老坛水泡豇豆中细菌相关性较为显著，醛类、含硫化合物、胺类挥发性物质与接种泡菜中细菌相关性较为显著。老坛水泡菜细菌群落丰富，弓形杆菌属(Arcobacter)、片球菌属(Pediococcus)对酯类、醇类、酸类、酚类挥发性物质的形成有影响，对应的挥发性成分的种类和含量更丰富。而接种泡菜以乳杆菌属(Lactobacillus)为绝对优势菌属，该菌属对挥发性物质的生成几乎没有贡献。指导工业上采用接种发酵方法时，可以适当丰富菌种、调整菌群结构，例如无毒害作用且对风味有良好影响的片球菌属，或是在后续生产中添加增香物质。