高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定海产调味品中无机砷的含量

孙胜枚，谈咏南，邓悦峰

(李锦记(新会)食品有限公司，广东 江门 529156)

现今人们的生活条件越来越好，对生活品质的追求也越来越高，特别是在食品的选择上，越来越注重食品安全问题。美食佳肴琳琅满目，但美食的背后不可或缺的是万千调味品，所以调味品的食品安全问题不容忽视，更值得关注。

砷是GB 2762-2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中的食品安全项目，包括总砷和无机砷。自然界中砷主要以无机砷和有机砷的形式存在，无机砷包括亚砷酸盐As(Ⅲ)和砷酸盐As(Ⅴ)，有机砷包括二甲基砷酸DMA、一甲基砷酸MMA、三甲基砷酸TMAO、砷胆碱 AsC和砷甜菜碱AsB[1]。国际癌症研究机构(IARC)将亚砷酸盐As(Ⅲ)和砷酸盐As(Ⅴ)列为Ⅰ级致癌物[2]，其中亚砷酸盐As(Ⅲ)的毒性大于砷酸盐As(Ⅴ),而砷酸盐As(Ⅴ)的毒性又大于有机砷，可溶性砷毒性大于不溶性砷[3]，而且As(Ⅲ)的毒性约为As(Ⅴ)的60倍[4]。综上所述，无机砷的毒性远大于有机砷。

海产品中砷含量很高，但主要以有机砷形式存在。同理，海产调味品中砷含量也很高，因此分离检测海产调味品中无机砷的含量，对评价海产调味品食品安全风险有重大意义。目前对于无机砷检测方法的国家标准方法有GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》和GB/T 23372-2009《食品中无机砷的测定 液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》，以及一些期刊文献中对香菇、大米、虾油、藻类和海产品中砷形态的测定[5-9]。国标法适用于常规的调味品食品检测，对于基质非常复杂的海产调味品，其高盐、高油或高蛋白特性使得国标法对海产调味品的检测存在一定局限性，目前还未发现针对海产调味品的无机砷含量测定的相关研究报道，本方法针对海产调味品优化国标前处理方法，解决了存在的干扰因素，对建立海产调味品中无机砷含量的检测方法意义重大。

1 材料与方法

1.1 试剂

浓硝酸：优级纯，浓度≥65%，为了得到高纯度的酸，使用前经亚沸蒸馏仪蒸馏备用；过氧化氢：CMOS级，浓度≥30%；氨水：ICP-MS级，浓度≥25%；三价砷标准溶液、五价砷标准溶液：品牌：Inorganic Ventures；砷甜菜碱标准溶液、一甲基砷标准溶液、二甲基砷标准溶液：研制单位：中国计量科学研究院；超纯水：经过超纯水机制得，电阻率≥18.2 MΩ·cm；阴离子交换分析色谱柱和阴离子交换分析色谱保护柱(品牌：Prin-cen)。

液氩或高纯氩气:纯度≥99.999%；高纯氦气：纯度≥99.999%。

1.2 仪器

Agilent ICP-MS 7900电感耦合等离子体质谱仪；Agilent 1260高效液相色谱仪；万分之一分析天平(精度0.0001 g，品牌:赛多利斯)；一次性注射器；水浴锅：温度可调至100 ℃；一次性塑料样品瓶；带盖的50 mL塑料离心管、50 mL和1000 mL容量瓶，每次使用前至少在10%的硝酸中泡12 h，用蒸馏水洗干净，在室温下自然晾干备用；0.45 μm尼龙66滤膜过滤器；超纯水机(Milli-Q)。

1.3 电感耦合等离子体质谱仪工作参数

使用的仪器为Agilent 7900电感耦合等离子体质谱仪(包括屏蔽炬、MicroMist雾化器),检测质量数m/z=75(As)，m/z=35(CL)，采集时间为0.5 s，具体参数见表1。

表1 电感耦合等离子体质谱仪工作参数Table 1 The working parameters of ICP-MS

1.4 液相色谱条件

1.4.1 色谱柱

阴离子交换分析色谱柱(柱长50 mm，内径4.6 mm，品牌：Prin-cen)和阴离子交换分析色谱保护柱(柱长50 mm，内径4.6 mm，品牌：Prin-cen)。

1.4.2 流动相

流动相A: 5 mmol/L的硝酸铵溶液；流动相B：60 mmol/L的硝酸铵溶液。洗脱方式：梯度洗脱(见表2)。进样体积：10 μL。

表2 洗脱程序Table 2 The elution procedure

1.5 样品处理方法

称取1.0 g样品于塑料离心管中，加入20 mL含3%过氧化氢0.15 mol/L硝酸混合溶液，于90 ℃水浴60 min，冷却至室温，加氨水调节pH至弱碱性，然后以6000 r/min离心10 min后取上清液，用0.45 μm滤膜过滤至塑料样品瓶待测，按同一操作方法做空白试验。

2 结果与讨论

2.1 阴离子色谱分析柱的筛选

为了选择分离效果更好的阴离子分析柱，对Hamilton、Agilent 和Prin-cen 3种品牌的阴离子色谱分析柱进行试验。

2.1.1 Agilent阴离子交换柱

根据国标法GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》中HPLC-ICP-MS法的色谱条件用Agilent阴离子交换柱对DMA、As(Ⅲ)、MMA和As(V)的混合标准溶液分离，色谱图见图1。

图1 4种砷形态标准溶液色谱图(20 μg/L)Fig.1 The chromatogram of standard solution in 4 arsenic species(20 μg/L)

分离所用时间为12 min，由图1可知，DMA 和As(Ⅲ)的保留时间比较接近，分离度不高，两个色谱峰靠得太近，往往会由于一个峰的峰面积太大而影响另一个峰的峰形，互相干扰而无法判断色谱峰拐点，不利于色谱峰的积分，从而不能准确定量。

2.1.2 Hamilton PRP-X100阴离子交换柱

使用Hamilton PRP-X100阴离子交换柱对As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA和AsB的混合标准溶液分离，色谱图见图2。

图2 5种砷形态标准溶液色谱图(5 μg/L)Fig.2 The chromatogram of standard solution in 5 arsenic species(5 μg/L)

由图2可知，AsB、MMA和As(Ⅲ)靠得太近，保留时间相差0.5～0.6 min，同样会由于一个峰的峰面积太大而影响另一个峰的峰形，互相干扰而无法判断色谱峰拐点，分离时间接近12 min。

2.1.3 Prin-cen阴离子交换柱

使用Prin-cen阴离子交换柱对As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA和AsB的混合标准溶液分离，色谱图见图3。

图3 5种砷形态标准溶液色谱图(5 μg/L)Fig.3 The chromatogram of standard solutions in 5 arsenic species(5 μg/L)

由图3可知，5种砷形态分离度高，分析所用时间为6 min,大大地提高了检测效率。

综上所述，Prin-cen阴离子色谱柱虽柱子短，但分离效果好，分离时间大大缩短，仅为6 min，能有效地提高检测效率。

2.2 As(Ⅲ)的影响因素

海产调味品样品基质复杂，高盐是其主要特点之一(如虾酱)，所以本试验通过纯水和氯化钠-硝酸溶液作溶剂分别配制标准溶液，对As(Ⅴ)和As(Ⅲ)的影响因素进行考察，结果发现采用氯化钠溶液配制的标准溶液中，As(Ⅲ)的峰形变宽、变矮，呈扁平状，见图4中b。值得注意的是，在接近4 min时有一个ArCl的分子离子干扰峰出现，但能被分离，不影响目标峰的定性和定量。

图4 1 μg/L 5种砷标准图 Fig.4 The chromatograms of standard solutions in 5 arsenic species(1 μg/L)

2.3 As(Ⅴ)的影响因素

2.3.1 C18小柱对五价砷的影响

国标法GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》中HPLC-ICP-MS法的前处理步骤中需要用C18小柱净化样品，为了验证C18小柱对五价砷的影响进行了以下试验:

以纯水为溶剂配制的砷5种形态的混合标准溶液通过C18净化小柱(品牌：CNW)净化后上机分析，结果发现As(Ⅴ)损失近50%，而其他砷形态基本没损失，叠图见图5(浅色是未过C18小柱的色谱图，深色是过C18小柱的色谱图)。

图5 5 μg/L 5种砷标准叠图Fig.5 The chromatogram of standard solutions in 5 arsenic species(5 μg/L)

因样品试液含0.15 mol/L HNO3，所以以0.15 mol/L HNO3为溶剂配制的砷5种形态的混合标准溶液，通过C18小柱净化后上机分析，结果发现经C18小柱处理后As(Ⅴ)损失近10%，而其他砷形态基本不损失。

通过试验证明C18小柱无论对水基体或者酸基体的As(Ⅴ)均有不同程度的吸附，严重者损失近50%，所以本方法将不使用C18小柱。

2.3.2 酸基体环境对系统中As(Ⅴ)的影响

为了试验酸基体环境对系统中As(Ⅴ)的影响，通过分析以0.15 mol/L HNO3为溶剂配制20 μg/L的As(Ⅴ)单标溶液，然后连续分析0.15 mol/L HNO3的空白溶液，数据见表3。

表3 酸基体对As(Ⅴ)的残留试验Table 3 The residue test of As (Ⅴ) on acid matrix

由表3可知，在酸基体中系统中As(Ⅴ)有残留，且不容易清洗干净，结论是含As(Ⅴ)高浓度样品会对下一个样品造成影响。根据Prin-cen阴离子交换色谱柱的pH适用范围在7～13之间，说明酸基体的样品进入系统后影响了流动相中缓冲盐的缓冲能力，从而导致pH改变，影响了色谱柱的性能。

2.3.3 弱碱性基体环境对系统中As(Ⅴ)的影响

为了验证弱碱性基体环境对系统中As(Ⅴ)的影响，用氨水将2.3.2中的标准溶液调节为弱碱性，仪器分析完标准溶液后，分析方法空白(用氨水将0.15 mol/L HNO3调节为弱碱性)，结果发现系统中As(Ⅴ)基本没有残留，数据见表4。证明调节样品的pH值至弱碱性的方法能避免As(Ⅴ)在系统中残留。

表4 碱基体对As(Ⅴ)的残留试验Table 4 The residue test of As(Ⅴ)on alkali matrix

2.4 前处理方法优化——提取液选择

为了寻求适用于海产调味品的无机砷含量检测的前处理方法，分别考察了GB/T 23372-2009《食品中无机砷的测定 液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》和GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》的前处理方法，进行了以下试验。

2.4.1 纯水-热浸提取法

参考GB/T 23372-2009《食品中无机砷的测定 液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》前处理方法，其特点是用纯水-热浸提，试验如下：

通过分析大米粉成分标准物质(GBW(E)100348)，见图6中b。检测结果：As(Ⅲ)108 μg/kg和As(Ⅴ)62 μg/kg，无机砷总量为0.17 mg/kg，而大米无机砷理论值为(0.18±0.03)mg/kg，无机砷总量的检测结果在允许范围内。

图6 大米粉成分标准物质色谱图Fig.6 The chromatograms of standard substances of rice flour

通过分析以虾酱为代表的海产调味品得到色谱图，见图7中a，发现As(Ⅲ)峰宽大,但As(V)分离较好，不受影响；通过添加As(Ⅲ)和As(V)混标再次确认As(Ⅲ)和As(V)的保留时间，见图7中b。经采用过氧化氢将As(Ⅲ)转化为As(V)，见图7中c，结果发现原As(Ⅲ)峰位置确实存在杂质干扰，As(Ⅲ)存在假阳性。

图7 虾酱(a)、虾酱加标(b)、虾酱使用过氧化氢 氧化法(c)的色谱图Fig.7 The chromatograms of shrimp sauce(a), spiked shrimp sauce(b)and shrimp paste oxidized by hydrogen peroxide(c)

综上所述，GB/T 23372-2009《食品中无机砷的测定 液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》前处理方法只适用于大米等植物性样品的检测，但处理虾酱等高盐的基质复杂的水产动物类样品时，因As(Ⅲ)峰有干扰，检测还存在一定局限性，可以采用过氧化氢将As(Ⅲ)氧化为As(V)，以As(V)计算无机砷总量。

2.4.2 硝酸-热浸提取法

参考GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》前处理方法,其特点是采用0.15 mol/L硝酸-热浸提，试验如下:

通过分析大米粉成分标准物质(GBW(E)100348)，见图6中c，发现在As(Ⅲ)处不出峰，无法定量，但As(V)分离较好，不受影响。但采用过氧化氢将As(Ⅲ)氧化为As(V)后，以As(V)计算无机砷总量，检测结果符合理论值。

同样，处理虾酱产品的色谱图时(见图8中b)，通过添加As(Ⅲ)和As(V)混标再次确认As(Ⅲ)和As(V)的出峰时间，见图8中 c，发现在As(Ⅲ)处仍然不出峰，无法定量，但As(V)能定性且分离较好，不受影响。

图8 As(Ⅲ)和As(V)混标(a)、虾酱(b)、 虾酱加标(c)色谱图Fig.8 The chromatograms of mixed standard solution As(Ⅲ)and As(V), shrimp sauce(b) and spiked shrimp sauce(c)

综上所述，采用两种国标方法都存在着局限性，主要体现在As(Ⅲ)不能分离或者出现干扰，而As(V)没有影响，因此本试验结论是可以用过氧化氢将As(Ⅲ)氧化为As(V)，以避免对As(Ⅲ)的影响，最后以As(V)计算无机砷总量。

2.5 提取效率

根据以上结论采用过氧化氢将As(Ⅲ)氧化为As(V)，以避免对As(Ⅲ)的影响，分别考察了纯水-热浸提加氧化法和0.15 mol/L HNO3-热浸提加氧化法的提取效率，试验通过对大米粉成分标准物质(GBW(E)100348)和DORM4-鱼蛋白进行对比，平行测定7次，结果发现，以0.15 mol/L HNO3-热浸提加氧化法的检测结果更接近理论值，数据见表5。

表5 提取效率对比Table 5 The comparison of extraction efficiency

2.6 准确度、精密度与回收率

对大米粉成分标准物质(GBW(E)100348)进行分析以验证方法的准确度并计算其变异系数，平行测定7次，数据结果见表6，结果均符合证书要求。对3种海产调味品：虾酱(高盐类)、沙茶酱(高油类)、蚝油(高蛋白类)进行3个水平的加标回收试验,并计算其相对标准偏差，数据结果见表7。

表6 大米粉标准物质分析结果Table 6 The analysis results of rice flour reference materials

表7 样品加标回收分析结果(n=7)Table 7 The analysis results of sample spiked recovery rates(n=7)

3 结论

本方法选用Prin-cen阴离子交换色谱短柱，在6 min内实现As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA和AsB的有效分离，能有效提高检测效率,在国标GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》前处理方法基础上进行优化，通过含3%过氧化氢0.15 mol/L硝酸溶液混合溶液提取样品,同时过氧化氢将As(Ⅲ)氧化为As(V)，以避免酸基体和盐基体对As(Ⅲ)的影响，然后将样品试液调节至弱碱性以解决As(V)的系统残留问题，最后以As(V)计算无机砷总量。试验结果表明本方法简单快捷、准确可靠，适用于海产调味品中无机砷的检测。