青春期隔离应激对实验动物的行为学研究进展

张雅芳，潘伟成，乔鹏，柳伊丽

(湖州师范学院医学院，浙江 湖州)

0 引言

多项研究发现，社会隔离极有可能威胁到人类的身心健康和生存质量，对健康造成的危害可能比肥胖症更为严重[1-2]，引发酒精滥用、抑郁等行为模式，并诱发某些精神疾病。而青春期正经历着大脑神经解剖，功能和化学重组。在这个神经和行为显著改变的特殊时期[3]，人类在社交、情感和认知方面发生巨大的改变[4]。影响该发育阶段的压力因素如隔离，能够增加个体发生精神分裂症等疾病的风险，并容易导致物质滥用[5]。已有大量的相关研究表明，青春期隔离使动物出现焦虑、攻击、酒精嗜好等各种行为异常[6-7]。其机制与神经、内分泌等系统的结构和功能的病理改变有关。故通过对动物模型的研究，旨在阐明青春期隔离对机体行为影响和神经生物学机制，为预防和治疗社会隔离而产生的抑郁、焦虑等提供实验依据，具有重要的学术价值和潜在应用价值。本文综合相关文献着重从青春期隔离对实验动物模型的行为改变方面及相关行为实验进行阐述。

1 动物模型的制备

实验一般采用啮齿动物模型尤其是大鼠、小鼠等，因它们具有行为情绪的变化特征，行为表现多样，情绪敏感且繁殖力和生命力强，而社会隔离使其产生的负面情感变化和神经生理效应与对人类的极其相似[8]，也有研究是以哺乳动物如猴子、鱼类等来构建模型。其次，动物在青春期展示出比幼年期和成年期更高水平的的社会行为，青春期动物一般在断奶后21 天( 青春期早期) 开始进行分组隔离，也有研究从中期和晚期开始隔离，有数据显示中期(35 天) 和晚期(42 天) 隔离的产生的行为活动的影响小于早期，包括互动活动如嗅探、对抗行为的频率、及偏好行为等[9]，也有研究表明在青春期早期和中期，动物的抑郁状态特征随着年龄的增大而愈加明显[10]。实验隔离的时程一般选择在6-7周，也有一些时长为2-3 周的短期隔离，一项研究表明小于3 周的隔离不会导致抑郁样改变，且社会交互实验数据也没有统计学意义[11]。因此，本文总结了动物模型特别是大鼠、小鼠在青春期经历隔离应激表现出行为方面变化，为未来进行相关研究提供发展方向的思考。

2 青春期隔离对动物行为的影响

2.1 焦虑相关行为

动物的焦虑行为可通过高架十字迷宫、旷场实验等行为实验进行量化。

2.1.1 高架十字迷宫

高架十字迷宫：利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态[12]。观察指标包括：开放臂进入次数、开放臂停留时间，闭合臂进入次数，闭合臂停留时间。进入开放臂次数及停留时间与大鼠的焦虑成负相关，进入开臂的频次和停留时间越短，表明动物焦虑状态越严重。先前大量实验提示动物在青春期受到隔离应激会表现为进入开臂频次和开臂停留时间的减少，出现焦虑样的情绪。雄性小鼠隔离3 周后，停留闭合臂中的时间延长[13]。雌性小鼠隔离8 周后，也出现焦虑样行为，进入开臂频次和停留时间显著减少[14]。这种变化可能与隔离时长有关，先前已有研究表明，在青春期3 至10 周的社会隔离状态下，啮齿类动物表现出类似焦虑的行为，最近有报道称雄性青春期大鼠隔离2 周而不是1 周后则出现停留开臂时间显著缩短、闭合臂时间显著延长等行为[15]。同时许多研究阐示，性别可能与这种行为改变有一定关系，雌性会因受到发情周期的影响而有时掩盖其焦虑样状态。PND( 产后)21 天雄性大鼠隔离6 周后，于新环境中表现出更大的运动活性，进入开臂频次和停留时间明显减少[16]。而雌性隔离后，和群居鼠在开臂频次、开臂时间、闭合臂频次及时间等参数上均没有统计学差异[17]。有相关研究证实，大鼠断奶后社会隔离诱导的焦虑可通过阻断中缝背核内的CRF2 受体逆转，提示CRF2 受体可能是早期生活压力源后治疗焦虑症的重要靶点。通过在侧脑室注射MC4 受体的选择性拮抗剂，焦虑症状减轻，通过免疫组化显示大鼠室旁核(PVN)、弓状体(ARC)、下丘脑背侧核(DMND)、腹侧核(DMNv)、杏仁核(CEA)中内源性α-黑素细胞刺激素(α-MSH)可能参与焦虑状态[18]。另外有实验显示四种柑橘叶子提取物能够增加小鼠在开臂中停留的时间，这可能是由于提取物中的黄酮类和萜类化合物用通过调节γ-氨基丁酸(GABA)受体增加氯离子通道开口的频率和引起神经元超极化，起抗焦虑剂的作用[19]，这些为阐明隔离诱导焦虑行为的神经生物学机制提供新的思路。

2.1.2 旷场实验

旷场实验：利用实验动物探索新场所的好奇心和畏惧新场地产生的趋避性来评价动物的自发行为和焦虑状态[20]。测量运动距离可反映动物的运动活性，通过记录实验动物进入中央区域的频次和停留时间来反映焦虑情况，中央区域停留时间减少表示焦虑样情绪的出现及探索性的减弱。早先研究揭示青春期受到隔离应激的动物往往会表现出运动增多[10]。同时，隔离引起动物在中心区域探索和停留时间减少，表现出焦虑样情绪。PND21 雄性大鼠隔离6 周在旷场实验中出现显著增加的焦虑性行为[21]。这种行为与隔离时长有一定关系，3 周及以上隔离可使动物出现焦虑性行为，隔离时长过短可能无法诱导出焦虑样情绪，而再社会化无法逆转隔离引起的焦虑行为增加。之前有研究对6 周龄雄性小鼠持续隔离5 周，旷场实验测量其在开放象限和中心区域花费的时间，前2 周基本没有变化，3 周以后开始出现焦虑相关的行为，5 周之后焦虑相关的行为显著增加[22]。隔离2 周再社会化3 周的雄性大鼠和隔离3 周再社会化2 周的雌性大鼠仍出现中心区域探索行为减少[23]。现有研究利用在小鼠中心杏仁核(CeA)注射催产素(OXT)减弱了5 周隔离诱导出的焦虑相关行为，OXT 通过催产素受体(OXTR)恢复CeA 中抑制性突触传递的功能，提示OXT 可作为抗焦虑药改善长期隔离引起的焦虑相关的缺陷[22]。

2.2 抑郁相关行为

2.2.1 强迫游泳实验

强迫游泳实验是迫使动物在有限空间里游泳而无法逃脱，进而产生绝望行为的一种应激抑郁模型[12]。通过测量动物在强迫游泳实验中的挣扎时间和不动时间来反映抑郁，挣扎时间的缩短和不动时间的延长表明“抑郁”行为的出现[24]。已有大量报道表明青春期隔离应激诱导动物出现不动时间的增加、挣扎时间的缩短，而这种改变可能与性别有一定关系，雌性由于受到发情周期的影响，实验往往呈现出较大的差异性。PND21 雄性大鼠隔离6 周表现出不动时间的显著延长[25]。在雄性大鼠群体中，从PND36 隔离2-3 周内未出抑郁样行为，而雌性隔离组表现出漂浮潜伏期和挣扎时间的减少[26]，小鼠群体隔离5 周雌性比雄性呈现更少的不动性，表现出抑郁行为[27]。这种抑郁相关行为改变可能还与隔离日龄有关，青春期早期隔离相对晚期更能诱导出动物的抑郁样行为，连续5 周测量PND42 小鼠强迫游泳实验，前3 周几乎没有变化，第4 周开始出现不动时间延长，第5 周出现显著的抑郁行为改变[22]，而从断奶后开始隔离，小鼠隔离3 周、大鼠短期隔离1 周即可诱导抑郁[28-29]。有研究提示跑步锻炼可以改善由隔离诱导的抑郁行为，8 周的跑步运动可显著降低雄性大鼠强迫游泳的不动时间，运动提高了神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)和突触蛋白I 的水平，还诱发了海马神经元的存活，而且还通过增加中缝核中5-羟色胺能细胞的数量来改善抑郁[23]。

2.2.2 蔗糖偏好实验

蔗糖偏好实验反映动物对奖赏的反应程度[30]，对奖励刺激缺乏兴趣代表快感的缺失，这是一种情感障碍(包括抑郁症)的表现形式[31]。通过测量蔗糖溶液和清水摄入量，计算蔗糖偏好率为蔗糖溶液消耗量(g)占清水和蔗糖溶液总消耗量的百分比，蔗糖偏好降低是抑郁症的重要表现形式。大部分研究显示青春期社会隔离会引起动物蔗糖摄入量的减少和蔗糖偏爱程度的降低，表现出不同程度的快感缺失。PND21 雄性大鼠隔离6 周和雄性小鼠隔离4 周后都出现了蔗糖消耗量减少和偏好程度降低的情况[32]。最近有报道提示这种偏好改变与蔗糖摄入时长有关，雌雄大鼠在蔗糖偏好实验的6h 和12h 的时间点上都表现出偏好显著降低的现象，在24h 的时间点上则没有观察到[33]。有实验揭示通过鼻内施用NT4-NAP(一种衍生的肽) / AAV(重组腺相关病毒)可改善抑郁行为，改善因隔离应激而引起的蔗糖偏好程度降低的情况。此外，通过3 周施用药物氟西汀增加了小鼠的蔗糖摄入，并且实时PCR显示该药物的施用恢复了应激引起的下丘脑GRPR(胃泌素释放肽受体) mRNA 和蛋白表达增加，这表明氟西汀作为抗抑郁药可改善压力应激下引起的兴趣降低等行为缺陷[34]。

2.3 乙醇摄入行为

生命早期暴露于慢性应激往往会导致乙醇摄入异常，引发乙醇使用障碍[35]。实验通过测量乙醇、水的消耗量以及血液中的乙醇浓度来评估乙醇的摄入及偏好。大量证据表明，不论雌性和雄性，青春期隔离应激会增加动物乙醇消耗，表现出乙醇的偏好。PND28 雄性大鼠隔离6 周和8 周，引起间歇性的消耗乙醇增加，相对水更优先，血液中的乙醇浓度也显著升高[36-37]。断奶后隔离39 天，雌雄性小鼠都表现出了消耗乙醇量的显著增加[27]，而哌替啶、普洛萘尔、度洛西汀等药物可以减少暴食样乙醇摄入[14-15]。有报道称2g / kg 乙醇诱导青春期隔离组大鼠伏隔核(NAc) 中的多巴胺(DA) 和去甲肾上腺素(NE) 释放增加，引起乙醇消耗显著增加，表明该神经物质可能参与隔离应激下乙醇摄入改变[38]。

2.4 精神分裂行为

前脉冲抑制(PPI)：是指利用震惊反射系统研究动物对突然的强烈刺激的反应以及数据分析。动物表现出的PPI 缺乏已成为精神分裂症和其他神经精神疾病遗传模型的标准行为测量之一[39]。给予实验动物听觉刺激，观察是否出现弱感觉刺激，表现出震惊反射的抑制作用，这种作用即为PPI。早先大量实验证明，动物青春期隔离可引起动物PPI 的持续性降低，这一表现可能与动物隔离开始日龄有关。有研究将雄性大鼠分别在PND28 与PND21 断奶隔离8 周，PND28 组大鼠显示出明显更高的PPI 缺陷率，这提示PPI 受损的大鼠的可行非药理学模型可能需要在PND28 开始进行隔离[40-41]。而这种由隔离诱导出这种PPI 损伤可以为许多抗精神药物治疗所逆转。DA 拮抗剂、药物奥氮平可逆转因隔离饲养诱导的PPI 缺陷，并倾向于增加基础PPI 水平[22]。有研究提示药物加兰他敏通过M 1 受体的激活改善了社会隔离诱导的PPI 缺陷，东莨菪碱(非选择性毒蕈碱拮抗剂)和西仑西平(M 1 受体拮抗剂)可抑制加兰他敏的作用[42]。另外，有研究显示隔离大鼠中会出现热休克蛋白60(HSP60) 升高，α- 突触核蛋白(α-syn) 和14-3-3蛋白(zeta /δ) 显著降低的现象，这些变化与PPI 缺陷的产生相关联，为隔离应激诱导的精神病样行为提供神经化学基础[43]。

2.5 攻击性行为

入侵者实验：是评价对外来入侵者的攻击行为和社会交往行为的一种实验方法。通过移入刺激鼠，观察实验动物的撕咬、追赶等攻击性行为，记录攻击潜伏期、攻击频率、攻击持续时间等来判断动物的攻击性行为[44]。早有证据发现实验动物在青春期受到社会隔离攻击性会显著增加，这种变化可能存在隔离时间差异的影响。青春期大鼠、小鼠经历连续隔离后，表现出更短的攻击潜伏期、更长的攻击持续时间及明显减少的非侵略社会接触时间[45-46]，PND21(青春期早期)和PND45(青春期晚期)小鼠隔离6 周后都出现了攻击性增加，且早期隔离引起的攻击性增加更显著[47]。后来攻击时间等不同，可能由于不同种系具有不同的遗传和环境相互作用。昆明小鼠隔离4 周、8 周表现出增加的攻击性，而2 周隔离足以引起BALB/c 小鼠攻击性增加，在相同隔离时间刺激下，昆明小鼠相对BALB/c 小鼠表现出更短的攻击潜伏期、更长的攻击持续时间[48]。断奶后雄性小鼠的侵略性和活动性显著加强，隔离早期较晚期出现更快更严重且更持久的攻击性行为，测试还显示了使用S-氟西汀、Allo 类似物、内源性大麻素、N-棕榈酰乙醇胺等物质可以降低隔离引起的攻击性升高现象[47]。此外，青春期隔离引起攻击性增强的机制可能与杏仁核中的ADAR1(p110) 蛋白表达和免疫反应性下降有关，并且实验通过免疫组织化学和蛋白质印迹法证明了5-HT(5-羟色胺)受体拮抗剂和反向激动剂可以通过恢复ADAR1(p110)蛋白的表达来缓解攻击性行为[49]。

2.6 空间学习和记忆方面

Morris 水迷宫：Morris 水迷宫是利用小鼠寻找水中休息场所的本能，通过定位航行实验和空间探索实验用于评估啮齿类动物空间学习和记忆能力。观察并记录动物入水并找到藏在水下逃避平台所需的时间(潜伏期)、游泳轨迹(总路程)等，分析和推断动物的空间学习和记忆等方面的能力。青春期隔离引起动物在水迷宫实验中表现出的行为并不一致，可能引起的空间记忆能力损伤受隔离时长的潜在影响，隔离时间过短会出现空间记忆没有损害的阴性结果。雄性大鼠从PND21 隔离2 周空间学习能力没有受损[50]。相似的是，大鼠隔离6 周后对空间位置的学习能力总体上没有差异[51]。而最近研究表明3 周龄雄性大鼠隔离90 天后出现空间学习记忆受损[52]。雄性小鼠隔离25 周，出现空间记忆能力的损害[53]。有报道称脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)作为神经系统分泌的神经营养蛋白，对大脑发育至关重要(包括海马功能、突触可塑性和学习记忆)，而通过长期运动训练可改善隔离诱导的海马BDNF 和NGF 含量降低的情况，改善认知障碍和学习记忆能力[52]。

3 总结

综上所述，以动物为研究对象构建青春期隔离模型，为药物试验提供了平台，对研究人类社会隔离具有重要意义。已有多项研究表明青春期隔离会引起动物多种行为显著和持续的改变，相关行为的影响是种系、性别、隔离时长等各因素综合作用的结果。此外，探究焦虑、抑郁、成瘾等行为的机制有助于阐明人类异常精神疾病的神经调节过程，进一步预防、研制治疗药物、治疗提供了理论基础和新的思路。