混菌发酵产酶活性与苹果酒风味物质构成的相关性分析

曾朝珍 ，康三江 ，张辉元，慕钰文，袁 晶，张海燕，张霁红，宋 娟，张 芳

（1.甘肃省农业科学院农产品贮藏加工研究所，甘肃兰州 730070；2.甘肃省果蔬贮藏加工技术创新中心，甘肃兰州 730070）

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是酿酒过程中的重要发酵剂，在酿酒过程中具有易控制、产物均一性好等优点[1]，也可以调节微生物群落的多样性及其代谢[2]。然而，为了改善果酒的香气、复杂性及口感，非酿酒酵母（non-Saccharomyces）也被应用到果酒酿造中，这些非酿酒酵母也负责酒精发酵，并会影响最终产品的感官特性[3-5]。在发酵过程中非酿酒酵母能够分泌糖苷酶、果胶酶、蛋白酶以及脂肪水解酶等多种酶类，这些酶与前体物质相互作用能够产生使酒体有更浓郁发酵香味的化合物，从而整体提升产品质量[6-9]。非酿酒酵母由于酒精发酵力较弱，为了能够保证完全发酵，将酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵以提高果酒质量。混合培养中，非酿酒酵母和酿酒酵母相互作用产生了不同的反应，从而对果酒品质变化也产生了不同的影响[10-14]。此外，一些研究也揭示了果酒酿造和发酵中的酶活性[6-9，15]。然而，混合菌种发酵实际上是一个复杂的微生物代谢过程，微生物在产生风味的化学反应中占主导地位，微生物的代谢，包括碳水化合物的水解，蛋白水解和脂质水解，决定了风味的类型和强度[16]。风味是消费者对果酒认可度的重要指标，还没有已知的报道将发酵过程中酿酒酵母和非酿酒酵母混合培养中酶活性的产生与苹果酒的最终香气特征联系起来。本试验以甘肃富士苹果为原料，采用德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）与酿酒酵母以不同的发酵方式研制苹果酒。通过测定酶活性及挥发性香气物质，研究苹果汁发酵过程中酶活性对苹果酒品质的影响，不仅可以拓展对混菌发酵条件下非酿酒酵母对果酒发酵过程中果酒品质改良的认识，也可为酿造高品质果酒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料和菌种

苹果（品种为富士）：甘肃省庆阳市；德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii，Td）1004、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）32168：中国食品发酵工业研究院有限公司。

1.1.1 化学试剂

甲醇、3-辛醇、乙酸正戊酯（均为色谱纯）：美国Sigma公司；β-葡萄糖苷酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶、果胶酶检测试剂盒：苏州科铭生物技术有限公司。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，121 ℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

BPC-70F生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；YXQ-70A立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；MIRCOCL 17R离心机、Multiskan GO 1510全波长酶标仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；QP2020 SYSTEM气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：日本岛津公司；XB-K-25血球计数板：上海市求精生化试剂仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将德尔布有孢圆酵母1004和酿酒酵母32168用接种环挑取2～3环菌苔接种于装液量为100 mL/250 mL液体PDA培养基中，然后在28 ℃静置培养72 h后用血球计数板确定菌种浓度，4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 苹果酒酿造工艺

参照曾朝珍等[15]的接种方式及发酵工艺制备苹果酒，富士苹果榨汁后，将德尔布有孢圆酵母（中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）1004）与酿酒酵母（CICC 32168）按单菌培养（Td 1004和Sc 32168，106CFU/mL）和混合培养（mixed cultures ofS.cerevisiaeandT.delbrueckii，MST）1：105CFU/mLS.cerevisiae/106CFU/mLT.delbrueckii；MST2：104CFU/mLS.cerevisiae/106CFU/mLT.delbrueckii）在接种量为6%条件下接种到800 mL苹果汁中，20 ℃条件下进行恒温发酵直至恒质量。测定苹果酒发酵过程中β-葡萄糖苷酶、果胶酶、酸性蛋白酶及α-淀粉酶活性及发酵结束后苹果酒的挥发性香气成分含量。

1.3.3 测定方法

（1）酶活的测定

参照曾朝珍等[15]的方法测定β-葡萄糖苷酶、果胶酶、酸性蛋白酶及α-淀粉酶酶活性。

（2）挥发性香气化合物测定

参照曾朝珍等[14]的方法测定挥发性香气成分。

样品预处理方法：取1 mL酒样，加入1 mL甲醇，50 μL 3-辛醇内标（630.8mg/L），100μL乙酸正戊酯内标（219.35 mg/L），漩涡混匀。取1 mL气相色谱瓶自动进样。

GC条件：进样口温度250 ℃，载气为氦气（He），流速1.2 mL/min。进样量1 μL，不分流进样。色谱柱为TB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升温程序40 ℃恒温2 min，以5 ℃/min的升温速度升至180 ℃，以15 ℃/min的升温速度升至250 ℃，保持5 min。

MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃。扫描范围33.00～350.00 amu。

定量分析：采用内标法进行半定量分析。酯类香气成分计算用乙酸正戊酯为内标，醇类用3-辛醇为内标，待测化合物质量浓度计算公式如下：

式中：ρ1为待检化合物的质量浓度，mg/L；ρ0为加入的内标化合物的质量浓度，mg/L；A1，待检化合物的峰面积；A0为加入的内标化合物的峰面积；V1为每次萃取的1.0 mL稀释样品的体积，mL；V0为加入的内标化合物的体积，μL。

1.3.4 数据分析

通过Excel 2003对试验数据进行整理，采用IBM SPSS Statistics 24.0和SIMCA14.1等软件对数据进行分析，试验数据以“平均值±标准偏差”表示。

2 结果与分析

2.1 苹果酒发酵过程中酶活性的变化

苹果酒整个发酵过程中相关酶活性出现了波动，它们的水平在整个发酵过程中都不是恒定的[15]。这意味着发酵过程中有大量的生化反应发生。因此，为了恰当的表达酶在整个过程中的行为，不同发酵方式产生水解酶的酶活性以曲线下面积（area under curve，AUC）表示，结果见表1。由表1可知，在纯培养发酵中，酸性蛋白酶和果胶酶的曲线下面积有显著差异性（P＜0.05），而β-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的曲线下面积差异不显著（P＞0.05）。混合培养中，产生水解酶的曲线下面积差异显著性与纯培养相同，且MST2中酸性蛋白酶和果胶酶的曲线下面积都显著高于MST1（P＜0.05）。

表1 不同发酵方式产生水解酶的曲线下面积Table 1 Area under curve of hydrolytic enzymes produced by different fermentation methods

2.2 不同发酵方式下苹果酒挥发性香气成分分析

对不同发酵方式下苹果酒挥发性香气成分进行定量分析，总离子流色谱图见图1～图4，各挥发性香气成分检测结果见表2。由表2可知，共鉴定出83种芳香族化合物，包括酯类、醇类、酸类、醛酮类。发酵过程中微生物的相互作用会影响香气成分的来源和产生[17]，不同发酵方式下香气成分的浓度差异具有统计意义（P＜0.05）。德尔布有孢圆酵母1004单独发酵中的酯类化合物含量最高为122.84 mg/L，而混合发酵中酯类化合物的含量比单菌培养更高并且其中一些酯类物质含量明显高于其各自单菌培养中的含量；德尔布有孢圆酵母1004单独发酵醇类物质含量最低为322.23 mg/L，而混合发酵醇类物质含量明显高于单独发酵含量。酸类物质含量在不同发酵方式下含量差异显著，其中，单菌培养条件下德尔布有孢圆酵母1004 产生的总酸含量较高为424.99 mg/L，而在混菌发酵条件下MST2具有最高的总酸含量为587.79 mg/L；醛酮类物质在酿酒酵母32168单独发酵下含量最低为49.04 mg/L，另外，混合发酵的醛酮类物质含量显著高于单独发酵中醛酮类物质，尤其是MST1中含量最高为371.93 mg/L。

图1 酿酒酵母32168发酵苹果酒挥发性成分总离子色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in cider by Saccharomyces cerevisiae 32168 fermentation

图2 德尔布有孢圆酵母1004发酵苹果酒挥发性成分总离子色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in cider by Torulaspora delbrueckii 1004 fermentation

图3 MST1混合发酵苹果酒挥发性成分总离子色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of volatile components in cider by mixed-strain fermentation of MST1

图4 MST2混合发酵苹果酒挥发性成分总离子色谱图Fig.4 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in cider by mixed-strain fermentation of MST2

表2 不同发酵方式苹果酒中挥发性香气成分测定结果Table 2 Determination results of volatile components in cider by different fermentation methods

续表

续表

2.3 混合发酵中酶活性与挥发性香气成分相关性分析

为了研究苹果酒混合发酵中酶活性与风味物质的相关性，本实验采用偏最小二乘回归分析（partial least-squares regression，PLSR）对所得结果进行统计分析。利用SIMCA-P软件，以不同混合发酵方式中的酶活性（AUC值）作为自变量，挥发性风味物质含量作为因变量，进行多个自变量对于多个因变量的回归建模。分别建立酶活性和酯类物质、醇类物质、酸类物质和醛酮类物质的若干模型，分析混合发酵过程中酶活性与风味物质变化的相关性。

2.3.1 混合发酵酶活性与酯类物质的相关性分析

以两种不同混合发酵方式中的β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、α-淀粉酶和果胶酶的酶活性（AUC值）作为自变量X，以15种酯类物质作为因变量Y，建立偏最小二乘回归分析（PLSR）模型。对构建的PLSR模型提取两种变量的主成分进行相关性载荷分析，结果见图5。

图5 酶活性与酯类物质的相关性Fig.5 Correlation between enzyme activity and esters

根据自变量X与因变量Y在坐标中的位置远近，判断它们之间的相关性大小。由图5可知，酸性蛋白酶和果胶酶与2-氧代-丙酸甲酯（B3）、乙酸1，2-环氧-3-丙酯（B15）呈现极强的相关性（P＜0.01），与甲瓦龙酸内酯（B12）较强相关性（P＜0.05）；α-淀粉酶与2-羟基-γ-丁内酯（B8）呈现较强相关性（P＜0.05），而β-葡萄糖苷酶与2-丙烯酸甲酯（B2）、硅烷二醇二甲酯（B4）、1,2-乙二醇单乙酸酯（B6）和硫酸二丁酯（B14）呈现极强相关性（P＜0.01），而与5-氧代-4-己内酯（B7）呈现较强相关性（P＜0.05）。本研究中，混合菌种发酵中β-葡萄糖苷酶的酶活性（AUC值）由单菌种发酵中的10.65 nmol/（min·mL）和10.31 nmol/（min·mL）增加到了15.11 nmol/（min·mL）和14.33 nmol/（min·mL），与非酵母菌混合发酵可能有助于苹果酒中酯类物质含量的提高[18]，而本研究中多变量分析结果表明是因为混合发酵中分泌β-D-葡萄糖苷酶较高，在此条件下与其相关性较强的酯类物质含量较单菌种发酵高。

2.3.2 混合发酵酶活性与醇类物质的相关性分析

以两种不同混合发酵方式中的β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、α-淀粉酶和果胶酶的酶活性（AUC值）作为自变量X，以24种醇类物质作为因变量Y，建立模型PLSR。对构建的PLSR模型提取变量的主成分进行相关性载荷分析，结果见图6。

图6 酶活性与醇类物质的相关性Fig.6 Correlation between enzyme activity and alcohols

由图6可知，酸性蛋白酶和果胶酶与2-甲基-1-丁醇（C3）、[R-（R*，R*）]-2,3-丁二醇（C6）、2-呋喃甲醇（C9）、4-羟基苯乙醇（C18）和1-丙氧基-2-丙醇（C24）相关性极强（P＜0.01），2-苯乙醇（C11）与果胶酶相关性较强（P＜0.05），对于3-甲基-1-丁醇（C4）、异山梨醇（C16）、3-呋喃甲醇（C21）和2,4-戊二醇（C22），与β-葡萄糖苷酶表现出极强的相关性（P＜0.01），而2-环己烯-1-醇（C19）表现出较强相关性（P＜0.05）。而α-淀粉酶与醇类组分无明显相关性。混合培养中醇类物质的含量也有增加，其中MST2混合培养中3-甲基-1-丁醇、[R-（R*，R*）]-2,3-丁二醇和2-苯乙醇的含量最高分别为44.88 mg/L、161.31 mg/L和45.62 mg/L，多元统计分析结果表明与发酵过程中的β-葡萄糖苷酶、酸性蛋白酶和果胶酶有关。一些研究表明β-葡萄糖苷酶和碳水化合物水解酶活性可能参与非芳香族前体的分解以及随后释放高级醇[19]。

2.3.3 混合发酵酶活性与酸类物质的相关性分析

以两种不同混合发酵方式中的β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、α-淀粉酶和果胶酶的酶活性（AUC值）作为自变量X，以15种酸类物质作为因变量Y，建立模型PLSR。对构建的PLSR模型提取变量的主成分进行相关性载荷分析，结果见图7。

图7 酶活性与酸类物质的相关性Fig.7 Correlation between enzyme activity and acids

由图7可知，β-葡萄糖苷酶与甲酸（D2）、2-丙烯酸（D6）和4-乙酰丁酸（D15）具有极强的相关性（P＜0.01），与4-羟基丁酸（D4）、2-甲基-2-丙烯酸（D9）、4-乙酰丁酸（D15）相关性较强（P＜0.05）；2-甲基丁酸（D8）、己酸（D12）与果胶酶具有极强的相关性（P＜0.01），乙酸（D1）与酸性蛋白酶和果胶酶相关性极强（P＜0.01）、而α-淀粉酶与酸类组分无明显相关性。脂肪酸通常与难闻的气味（奶酪和酸味）有关，但也在平衡果酒风味方面起着关键作用，因为它们存在于发酵培养基中可以部分阻止相应乙酯的水解[20]。本研究统计分析结果表明，乙酸较其他酸类物质含量较高，其中MST2混合发酵中乙酸含量最高为425.17 mg/L，而MST2中酸性蛋白酶和果胶酶含量相对较高，说明二者之间具有正相关性，这一点在多变量分析中得到了反映。

2.3.4 混合发酵酶活性与醛酮类物质的相关性分析

以两种不同混合发酵方式中的β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、α-淀粉酶和果胶酶的酶活性（AUC值）作为自变量X，以29种醛酮类物质作为因变量Y，建立模型PLSR。对构建的PLSR模型提取变量的主成分进行相关性载荷分析，结果见图8。

图8 酶活性与醛酮类物质的相关性Fig.8 Correlation between enzyme activity and aldoketones

由图8可知，羟基丙酮（E1）、二羟基丙酮（E8）、2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-吡喃-4-酮（E10）、5-羟甲基糠醛（E13）、2,4-二羟基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（E15）、1-（1,3-二氧杂戊环-2-基）丙酮（E19）、1-羟基-2-丁酮（E26）、3,5-二羟基-2-甲基-吡喃-4-酮（E27）、2-甲基1,3-环戊二酮（E28）与β-葡萄糖苷酶相关性极强（P＜0.01），而与2,5-二甲基呋喃-3,4（2H，5H）-二酮（E7）、5-甲基-2-呋喃甲醛（E12）、5-羟甲基二氢呋喃-2-酮（E18）、5,9-二甲基-2-癸酮（E29）相关性较强（P＜0.05）；酸性蛋白酶和果胶酶均与1-（2-呋喃基）-乙酮（E2）、2-环己烯-1-酮（E17）、1，4-二氧螺环[2.4]-5-庚酮（E20）、5-乙基-3-羟基-4-甲基-2（5H）-呋喃酮（E21）、甘油醛（E25）相关性极强（P＜0.01），3-丁基-2-羟基-2-环戊烯-1-酮（E23）只与酸性蛋白酶相关性极强（P＜0.01），而α-淀粉酶与酸类组分无明显相关性。本试验中混合发酵后β-葡萄糖苷酶活性的含量显著提高，而多变量统计数据表明混合发酵中的醛酮类物质含量和酶活性之间存在关联，而醛酮类物质的含量变化与相关分析的结果一致。

3 结论

本试验研究中混合接种非酿酒酵母和酿酒酵母会影响苹果酒的香气特征。几种香气化合物与酵母酶活性呈正向显著相关。此结果可以为在混合发酵中使用酿酒酵母作为提高苹果酒风味复杂性的发酵剂提供理论依据。本研究结果有助于更好地理解酵母菌的酶活性对苹果酒发酵过程中发生的化合物转化的影响，而提高对复杂发酵条件中微生物相互作用的理解。不同接种方式和发酵过程中不同发酵剂之间的相互作用，以及酶活性对香气化合物的调控的分子机制需要进一步研究。