HPLC-DAD同时测定合黄滋阴合剂中5种有效成分含量

沈 洁，万 丹，徐 冲

(重庆市中医院 药剂科，重庆 400021)

合黄滋阴方由百合、生地黄、黄连、黄芩、白芍、阿胶、甘草、大枣、浮小麦加工而成，用于治疗阴虚发热、津伤便秘、心神不宁、神志恍惚、虚烦心悸、失眠多梦等病症。方中百合、生地黄为君药，为张仲景的百合地黄汤，百合滋阴清热，白色入肺经，可养肺阴；生地黄清热滋阴，生津止渴，黑色入肾，可滋肾阴[1]；阿胶滋养肾阴，使肾水上济于心，交通心肾[2]；黄连、黄芩清热泻火而固护肾阴[3-4]。白芍敛阴止汗，平抑肝阳，白芍味酸，甘草味甘，白芍、甘草酸甘化阴[5-7]；大枣、浮小麦养心阴，除烦热[8]。全方共奏养阴泻火、益肾宁心之功效。

合黄滋阴方为我院妇科拟开发的院内制剂，尚无质量标准等相关研究。通过对百合、地黄等药材的文献调研[9-15]及相关实验，本研究制定了HPLC同时测定其有效成分芍药苷、王百合苷、毛蕊花糖苷、黄芩苷、黄芩素含量的方法，现报道如下。

1 材料与试剂

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱(DAD二极管阵列检测器)；Waters Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；QUINTIX65-1CN型电子天平(十万分之一，德国 Sartorius集团)；JA3003J型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TGL-18C-C型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；AXLM1820-2型超纯水机(重庆阿修罗科技发展有限公司)。

1.2 试药

王百合苷 (成都德斯特生物技术有限公司，批号：DST190601-071，纯度：98.0%)；芍药苷(上海安谱实验科技股份有限公司，批号：G3160010，纯度：98.0%)；毛蕊花糖苷(批号：中国食品药品检定研究院，111530-201713，纯度：92.5%)；黄芩苷(中国食品药品检定研究院，批号：110715-201821，纯度：95.4%)；黄芩素(中国食品药品检定研究院，批号：111595-201607，纯度：98.5%)；乙腈(色谱纯，上海霍尼韦尔贸易有限公司)；磷酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；其余试剂为分析纯，水为超纯水；合黄滋阴合剂(批次20200113、20200115、20200121、20200122)，规格：200 mL/瓶；阴性样品自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱：0～20 min，16% A；20～30 min，16%～22% A；30～55 min，22～50% A；55～60 min，50% A，后运行2 min；检测波长：0～20 min，230 nm；20～26 min，334 nm；26～35 min，310 nm；35～60 min，280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

对照品溶液制备：分别精密称取芍药苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黄芩苷、黄芩素适量，加70%甲醇配制成混合对照品溶液，其中芍药苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黄芩苷、黄芩素的质量浓度分别为360.10、125.60、72.00、91.20、71.60 μg/mL。

供试品溶液制备：取合黄滋阴合剂(20200113) 5 mL，加入70%甲醇定容，超声(功率：500 W，频率：40 kHz) 30 min，冷却后用70%甲醇补足损失的质量，摇匀，离心(5 000 r，5 min)，取上清液，滤过，即得。

阴性溶液制备：根据合黄滋阴处方组成制备阴性样品，按照供试品溶液的配制方法制备缺百合、生地黄、白芍、黄芩的阴性供试品溶液，备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定。在该色谱条件下，各待测成分色谱峰均可以达到基线分离，理论塔板数均>5 000。供试品与对照品相应位置上，保留时间一致，阴性样品无干扰。色谱见图1。

1：芍药苷；2：毛蕊花糖苷；3：王百合苷；4：黄芩苷；5：黄芩素

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液1、2、3、5、8、10 mL，置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，摇匀，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标(Y)，各对照品浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得到线性关系，见表1。

表1 合黄滋阴合剂中各成分的线性关系考察

2.3.3 检测限和定量限考察 取“2.2”项下对照品溶液，逐级稀释，按照“2.1”项下色谱条件，分别进样6次，记录色谱图。以信噪比(S/N)=3∶1时计算检测限，以S/N=10∶1时计算定量限。结果芍药苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黄芩苷、黄芩素的检测限分别为0.02 μg /mL、0.06 μg/mL、0.07 μg/mL、0.05 μg/mL、0.04 μg/mL，定量限分别为0.07 μg/mL、0.20 μg/mL、0.22 μg/mL、0.16 μg/mL、0.12 μg/mL。

2.3.4 精密度试验 精密吸取同一份混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，计算得芍药苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黄芩苷、黄芩素的峰面积RSD(n=6)分别为1.06%、0.63%、0.65%、0.47%、0.44%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批次(20200113)的合黄滋阴合剂，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，平行6份，计算得芍药苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黄芩苷、黄芩素RSD(n=6)分别为3.20%、2.37%、1.61%、0.72%、1.89%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验 取该批次(20200113)合黄滋阴合剂制成样品溶液，于室温下放置0、2、4、6、12、24 h后进样，计算得芍药苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黄芩苷、黄芩素的峰面积RSD(n=6)分别为2.91%、0.72%、0.55%、3.68%、2.25%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.7 加样回收试验 取适量的合黄滋阴合剂 (20200113)样品约2.5 mL，共6份。分别加入含芍药苷360.10 μg/mL、毛蕊花糖苷12.56 μg/mL、王百合苷72.00 μg/mL、黄芩苷91.20 μg/mL、黄芩素35.80 μg/mL对照品混合溶液50 mL，按照“2.2”项下的方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算得芍药苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黄芩苷、黄芩素平均回收率分别为98.30%、97.21%、96.11%、98.53%、95.34%，RSD分别为1.73%、1.83%、1.94%、1.50%、2.46%。

表2 合黄滋阴合剂中各成分的加样回收率试验

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按照上述色谱条件，进行芍药苷、毛蕊花糖苷、王百合苷、黄芩苷、黄芩素的含量测定(n=3)，结果见表3。

表3 样品含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 有效成分的选择

本研究中百合、地黄为君药，通过文献[16]调研并结合实验结果表明王百合苷为所用百合(百合科)主要有效成分。由于合黄滋阴合剂采用水煎煮，地黄中梓醇稳定性差[12，14-15]，结合《中国药典》(2015年版)规定，选择地黄毛蕊花糖苷为检测指标之一；白芍、黄芩为臣药，结合《中国药典》(2015年版)规定，分别选择芍药苷、黄芩苷为检测指标，文献表明黄芩中亦含有大量黄芩素[17-19]，故选择黄芩素为指标性成分之一。方剂中阿胶虽为臣药，但由于阿胶为烊化后加入浓缩煎液中再定容，且其有效成分在本实验条件中不易被测得，故不考虑将其纳入考察，黄连、大枣、浮小麦、甘草等饮片为佐使药，从方剂组成及饮片本身的有效成分考虑，均不适宜纳入考察。综上所述，本研究将芍药苷、王百合苷、毛蕊花糖苷、黄芩苷、黄芩素5种有效成分作为合黄滋阴合剂含量测定的考察指标。

3.2 流动相的选择

本研究对乙腈-水、乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液四种流动相进行梯度洗脱考察。研究发现，乙腈-0.1%、乙腈-0.2%磷酸溶液在梯度洗脱下各组分分离效果较好，从仪器维护的角度考虑，本实验选择乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相。

3.3 检测波长的选择

结合文献[16]，并通过DAD全波长扫描得知，芍药苷、王百合苷、毛蕊花糖苷、黄芩苷、黄芩素的最大吸收波长分别为230 nm、310 nm、334 nm、280 nm、280 nm，故本研究设定检测波长分别为230 nm、310 nm、334 nm、280 nm、280 nm，可以满足各指标成分含量测定的要求，保障实验结果的准确性。

3.4 样品提取工艺的选择

本研究对提取溶剂、提取方式、提取时间分别进行优化考察。提取溶剂：在水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇，甲醇、70%乙醇溶液中，70%甲醇提取各组分含量最高，且各组分分离情况最为理想。提取方式：对回流提取与超声提取效果分别进行考察，研究发现回流提取的各组分含量稍高于超声提取，但差异并不明显，从实验的便捷性、安全性及环保性角度综合考虑，采用超声提取方式进行提取。提取时间：本研究分别对超声提取时间20、30、40 min进行考察，结果表明30、40 min时各组分含量差异不明显，而20 min超声所得各组分含量明显低于30 min和40 min所测结果，因此，本实验制备供试品提取时间为30 min。综上，本研究采用70%甲醇超声提取30 min，制备供试品溶液。

4 结论

本研究采用HPLC-DAD同时测定合黄滋阴合剂中芍药苷、王百合苷、毛蕊花糖苷、黄芩苷、黄芩素5种成分的含量，专属性强，结果准确，使得该合剂质量控制标准更严谨完善，使其生产实践中的多指标质量控制和评价成为可能。