高盐饮食对小鼠认知功能的影响及其与肠道菌群的关系

雷超，刘聪，刘亭，刘志华

广州医科大学附属第五医院中心实验室，广州510700

随着生活水平的提高，不良饮食习惯作为多种疾病发生的危险因素而逐渐受到关注，其中高盐饮食被公认为是高血压、心脏病等心脑血管疾病的危险因素。高盐饮食指每日饮食中超过6 g 的钠盐摄入量，除食用盐外还包括酱油、味精等调味品。近年来少数基础研究提出，高盐饮食还可能影响认知功能，但其具体作用机制尚不明确［1］。研究显示，菌—脑轴在调控神经系统生理功能方面发挥重要作用［2］。临床研究显示，与健康人群相比，患有认知功能受损性疾病的患者，如阿尔茨海默病、精神分裂症，常表现出特征性的肠道菌群结构改变。突触素（SYP）是一种与突触结构和功能密切相关的膜蛋白，是突触发生和突触可塑性的重要标志，而突触丢失及功能异常与脑的高级功能，如学习记忆和认知功能受损等有关。2019 年 10 月－2020 年 5 月，本研究观察了高盐饮食对小鼠认知功能的影响，并探讨其机制是否与肠道菌群紊乱有关。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠20只，5周龄，体质量约20 g，均购自广东省医学实验动物中心；适应性喂养7 d，饲养期间动物房室温维持（22±2）℃，保持每天12 h光照并进行通风。主要试剂：老鼠普通维持饲料（0.2% NaCl）和高盐饲料（8% NaCl）均购自广东省医学实验动物中心，RNA抽提、cDNA 合成试剂盒及PCR 反应体系均购自日本TaKaRa公司，PCR引物由广州艾基生物技术有限公司设计合成。

1.2 动物分组及处理方法 将20 只SPF 级雄性C57BL/6 小鼠随机分为正常饮食组和高盐饮食组，每组10只。正常饮食组给予普通维持饲料喂养，高盐饮食组给予高盐饲料喂养，两组均喂养16周。

1.3 小鼠认知功能观察

1.3.1 偏爱率 采用新异物体识别实验。实验前3 d，每天依次将小鼠放入长、宽、高均为50 cm 的黑色塑料箱中，让其在里面适应15 min 后取出。第4天正式实验时，室温保持25 ℃，用乙醇均匀喷洒箱壁后擦干以清除气味；在距侧壁15 cm 处平行放入两个相同颜色和大小的长方体，在对侧放入小鼠，让其在箱内探索8 min 后取出；20 min 后，用乙醇喷洒箱壁后擦干，用圆柱体取代其中的一个长方体，放入小鼠让其探索5 min，记录小鼠探索两个物体的总时间以及探索圆柱体的时间，探索时间为小鼠使用鼻子或嘴巴、前爪接触或距离物体2～3 cm 的时间。偏爱率=探索圆柱体的时间/探索两个物体的总时间×100%。

1.3.2 自发反应交替率 采用Y 迷宫实验。本实验使用的Y 迷宫有三臂，各臂夹角均为120 ℃，每一臂尺寸均为40 cm×10 cm×15 cm，在迷宫各个臂内贴上不同的几何图形，作为视觉标记。将小鼠放在一个臂的末端，记录8 min 内小鼠进入各个臂的顺序，并在结束时喷洒乙醇，充分消除残留的气味。自发性交替反应被定义为连续进入3 个臂，如1、2、3 或1、3、2。自发反应交替率=实际自发交替反应次数/（进臂总次数-2）×100%。

1.4 粪便肠道菌群差异性检测 采用高通量测序法进行16S rDNA 基因V4 片段的基因测序。收集两组小鼠的新鲜大便，将样品（＞0.5 g）置于标准冷冻管中，立即置于液氮保存，样本检测由北京百迈客生物科技有限公司完成。首先对送检DNA 样品进行检测，检测合格后的样品构建文库；回收目的扩增片段，用 T4 DNA 聚合酶、Klenow DNA 聚合酶和 T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK），将打断形成的黏性末端修复成平末端，再通过3'端加碱基腺嘌呤（A），使得DNA 片段能与3'端带有碱基胸腺嘧啶（T）的特殊接头连接；或者设计合成含有测序接头的双索引序列融合引物，以基因组DNA 为模板进行PCR 反应，利用磁珠法筛选目的扩增片段，最后用合格的文库进行DNA 簇（DNA cluster）制备和测序。采用Mothur（version v.1.30）软件分析OUT 和α 多样性；OTU 即分类操作单元，是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系、种、属、分组等）设置的同一标志，本研究采用序列之间的97%相似性把某一个分类单元定义为一个OTU，每个OTU对应于一种代表序列；α多样性指标包括 Chao1、Ace、Shannon 和 Simpson。采用Metastats软件比较两组门水平和种水平上的菌群相对丰度。

1.5 脑组织SYP mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后处死，取出脑组织，用生理盐水仔细清洗表面血迹。使用TRIzol 试剂盒提取脑组织总RNA，逆转录合成cDNA，参照试剂盒说明书进行操作。PCR 反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，之后95 ℃持续40个循环，每个循环15 s，60 ℃ 1 min。引物序列：SYP上游引物 5′-TGGAGTGTGCCAACAAGACG-3′、下游引物5′-CAAACACAGCCACGGTGACAA-3′，内参β-actin 上游引物 5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′、下游引物 5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。所有反应设2 个复孔，实验重复2 次。采用2-ΔΔCt法计算SYP mRNA相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS15.0 统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠认知功能相关指标比较 高盐饮食组小鼠偏爱率、自发反应交替率分别为62.4% ±2.4%、57.2% ± 3.0%，正常饮食组分别为72.0% ±3.1%、69.1% ±2.3%，两组比较P均＜0.05。

2.2 两组小鼠粪便肠道菌群构成比较 高盐饮食组小鼠粪便菌群OUT 为168.0 ± 11.7，正常饮食组为155.4 ± 12.7，两组比较P＞0.05。高盐饮食组小鼠粪便菌群 α 多样性指标 Ace、Chao1、Shannon、Simpson 分 别 为 196.1 ± 7.3、179.1 ± 8.2、3.0 ±0.1、0.120 ± 0.010，正常饮食组分别为 181.2 ±9.9、174.5±9.3、3.1±0.2、0.100±0.007，两组比较P均＞0.05。门水平：高盐饮食组小鼠粪便菌群中厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）的相 对 丰 度 分 别 为 49.29% ± 12.73%、35.26% ±14.31%、6.42% ± 7.11%、0.45% ± 0.17%，正常饮食组分别为41.25% ± 13.20%、48.28% ± 8.73%、6.29% ± 4.47%、0.26% ± 0.19%，两组比较P均＞0.05（OSID 码图1）。种水平：高盐饮食组小鼠粪便菌群中嗜黏蛋白艾克曼菌（A.muciniphila）、产酸芽孢杆菌（B.acidifaciens）、柔嫩梭菌菌（C.leptum）、啮齿动物粪杆菌（F. rodentium）相对丰度分别为7.024% ± 0.461%、0.243% ± 0.037%、0.047% ±0.028%、1.292% ± 0.145%，正常饮食组分别为2.113% ± 0.023%、0.033% ± 0.002%、0.213% ±0.048%、0.023%±0.003%，两组比较P均＜0.05。

2.3 两组小鼠脑组织SYP mRNA 相对表达量比较 高盐饮食组与正常饮食组小鼠脑组织SYP mRNA相对表达量分别为0.811 2±0.039 0、1.000 0±0.054 6，两组比较P＜0.05。

3 讨论

认知功能是脑的重要功能之一，主要指学习与记忆能力。研究表明，认知功能障碍相关性疾病患者大多出现具有特征性的肠道菌群结构变化，说明肠道菌群与认知功能受损可能有关［3］。肠道菌群主要存在于结肠，种类估算有1千种以上，主要分为四大菌门：Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria，不同种类细菌的数量维持动态平衡，可作为整体参与食物消化吸收、维持肠上皮屏障功能、调节免疫等机体生理活动［4］。肠道菌群的结构、多样性变化时，可不同程度地影响宿主的生理功能，或可导致病理改变。近年来肠道菌群与全身多系统相互作用的机制陆续被提出，如肠道菌群—肠—肝轴、肠道菌群—肠—肺轴以及本文研究的肠道菌群—肠—脑轴［5］。既往主流观点强调中枢神经系统在肠道菌群—肠—脑轴调控中占主导地位，随着菌群测序技术的成熟及粪菌移植方法的流行，越来越多的研究报道认为肠道菌群在调控中枢神经系统的发育和功能状态方面存在不容忽视的作用。因此，本研究探讨肠道菌群紊乱与不良饮食习惯诱导的认知功能损伤的相关性。

本课题组既往行为学结果显示，普通小鼠认知功能存在个体间差异，为避免抽样误差，实验应用随机分组原则；其次两组小鼠均选取相同的品系，并在相同的环境中饲养，避免遗传、环境等因素对肠道菌群的影响。与之前的高盐饮食研究［6］不同的是，我们并未在小鼠饮用水中添加一定浓度的钠盐，这能更好地模拟人类的不健康饮食习惯。Y 迷宫主要用于小鼠辨别性学习，工作记忆和参考记忆的测试；新异物体识别实验可用于非空间记忆的测试。这两种方法具有让小鼠在自由活动状态下进行学习记忆的特点，能充分反映小鼠的认知功能状态。本研究结果显示，高盐饮食小鼠的自发反应交替率和偏爱率均明显降低，说明高盐饮食降低了小鼠的认知功能。此外，高盐饮食小鼠脑组织SYP mRNA 相对表达量下降，而SYP在神经递质释放、突触可塑性和突触发育等重要生理过程中均发挥重要作用［7］。因此，高盐饮食可能通过影响神经系统突触相关生理过程而损伤小鼠的认知功能。

本研究采用OUT 和α 多样性来评估肠道菌群多样性的变化，α 多样性有4 种衡量指标，分别为Chao1、Ace、Shannon 和 Simpson，结果显示两组OUT和α多样性指标比较均无统计学差异。肠道菌群的构成主要由饮食和生活方式决定，遗传因素的影响很小，由饮食习惯不同导致的肠道菌群多样性变化主要表现为食物种类差异，而高盐饮食未改变饮食中各种营养素的占比，对肠道菌群整体的生存、代谢方式影响较小，故本研究显示高盐饮食对肠道菌群多样性的影响较小，同时暗示肠道菌群受到高盐饮食的影响或许仅局限于少数有重要意义的菌种上。为了进一步探索肠道菌群构成的变化，我们首先分析了两组肠道菌群构成在门水平的差异，结果显示高盐饮食组Firmicutes 相对丰度升高，而Bacteroidetes 相对丰度降低，但并无统计学差异。研究显示，肠道菌群结构的这一变化不仅与肥胖、结肠炎、冠心病等疾病有关［8］，近年来也被发现与神经系统疾病如抑郁症、精神分裂症、自闭症等有关［9］。在种水平上，我们进一步找出了四种差异细菌，分别为A.muciniphila、B.acidifaciens、C.leptum、F.rodentium。A.muciniphila 是2004 年在人体肠道中分离出来的菌种，在人类消化道中普遍存在，占比3%～5%，补充A. muciniphila 或可延缓衰老，增强抗肿瘤药物疗效［10］。B.acidifaciens 可促进结肠中分泌型 IgA 的产生，进而保护肠上皮黏膜［11］。这两种菌群丰度的增加可能来源于长期高盐饮食对肠道内环境的破坏而引起的代偿性保护反应，这一独特的发现有待未来深入研究。F. rodentium 与人类疾病相关的研究甚少。C.leptum 是一种产丁酸盐菌，而丁酸盐被发现可抑制帕金森病模型小鼠的神经细胞凋亡以及组蛋白乙酰化，从而改善认知功能；其次，丁酸作为短链脂肪酸之一，亦有助于抑制机体炎症反应、调节免疫功能［12］。结合在门水平上Firmicutes 丰度增加及Bacteroidetes 丰度减少与机体促炎细胞因子的增多相关，而脑组织慢性微炎症状态与认知功能下降相关。因此，我们推测高盐饮食可损伤小鼠的认知功能，可能主要与促炎相关的肠道菌群失调及少数几种细菌相对丰度改变有关，尤其是与产丁酸盐菌C.leptum 的减少相关，但其因果关系验证尚需粪菌移植等菌群干预措施进一步验证。

综上所述，高盐饮食可损伤小鼠的认知功能，其机制可能与肠道菌群紊乱有关。虽然许多关于肠道菌群—肠—脑轴参与饮食模式调控疾病发生发展相关的研究均强调肠道菌群应作为一个整体发挥效应，但本研究认为高盐饮食对肠道菌群的影响应着重于验证少数受到影响的细菌，高盐饮食与C.leptum 减少的相关性有待在更大样本量的基础实验及临床试验中进行验证，以及C.leptum 是否是高盐饮食损伤认知功能的关键介质仍有待确定。