七氟醚麻醉对脑缺血再灌注损伤大鼠学习记忆能力的影响

苗亚飞 杨木强 司马靓杰 闫俊强

河南科技大学第一附属医院，河南 洛阳 471003

缺血性脑卒中是指由于脑的供血动脉(颈动脉和椎动脉)狭窄或闭塞、脑供血不足导致脑组织坏死的总称。目前临床上对于缺血性脑卒中的治疗主要集中于溶解栓子，恢复正常血运，但血流再通时往往会造成脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)[1]，从而带来严重的后遗症，因此减轻再灌注损伤是治疗缺血性脑卒中的重点。海马组织对缺血后再灌注较为敏感，海马损伤后往往会伴随学习和记忆能力等认知功能的损害，影响患者的生活质量。CIRI的发病机制目前尚不明确，研究显示炎症反应是CIRI的主要原因之一[2-3]。S100β是细胞内钙结合蛋白家族S100蛋白的成员之一，在中枢神经系统中表达丰富，研究表明组织细胞受损后S100β蛋白大量释放，触发炎症反应，促进应激相关酶的释放，从而导致细胞功能发生障碍，在神经细胞受损及炎症反应加重中发挥作用[4]。颗粒蛋白前体(progranulin，PGRN)是由Grn基因编码的一种分泌性糖蛋白，具有促进细胞增殖、营养、抗炎等多种生理功能[5]，PGRN在神经炎性反应调节中发挥重要作用，研究表明炎性刺激会导致星形胶质细胞内PGRN表达升高[6]；此外，PGRN参与多种神经退行性疾病生理过程，并影响病后的认知功能与学习记忆能力[7-8]。七氟醚是临床上常见的一种吸入性麻醉剂，研究表明七氟醚能够在缺血性脑损伤过程中发挥脑保护作用[9]，因此，探究CIRI后大鼠学习记忆能力改变，以及S100β和PGRN的表达改变，可能为降低再灌注损伤提供新的思路。

1 材料与方法

1．1药品试剂与仪器七氟醚购于北京迈瑞达科技公司，Anti-S100 beta抗体购于英国Abcam公司，Anti-Progranulin/PGRN抗体购于英国R&D公司，HRP-山羊抗兔Ig G购于武汉Abbkin公司，蛋白提取试剂盒、蛋白含量检测试剂盒及凝胶配制试剂盒均购于江苏凯基生物公司，普通抗体稀释液购于北京博奥森。

全自动冷冻研磨机购自上海净信公司，便携垂直电泳仪购自美国Bio-Rad公司，多功能成像仪购自美国通用电气，多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher公司，纯水制造机购自成都超纯科技公司，全自动制冰机购自英国Grant公司，R500通用型小动物麻醉机购于深圳瑞沃德生命科技有限公司。

1．2实验动物与分组取30只雄性SD大鼠，体质量(200±50)g，SPF级，购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证编号：SCXK(京)2006-0009。将30只雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、脑缺血再灌注组(CIRI)以及七氟醚后处理组(SEVO)，每组10只。

1．3模型建立采用改良Longa法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型[10-11]，CIRI组及SEVO组大鼠使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，颈旁行正中切口，玻璃分针分离颈部动脉，寻找到颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，使用动脉夹夹闭颈内动脉，在颈外动脉上做一切口，插入线栓，缓慢沿颈内动脉走向推进至稍有阻力为止，表明线栓已到达大脑前动脉端，可阻断大脑中动脉血流。2 h后拔出线栓，再灌注24 h。Sham组仅做颈旁切开，不做线栓插入处理。

1．4七氟醚后处理将SEVO组大鼠置于麻醉台，使用瑞沃德小动物麻醉机面罩吸入七氟醚及氧气混合气体，七氟醚体积分数3%，氧流量为1 L/min，持续吸入30 min。Sham组及CIRI组大鼠单纯吸入氧气30 min，氧流量保持一致。麻醉结束后将大鼠置于加热垫上至自然苏醒。

1．5神经功能缺损评分模型建立大鼠苏醒后，各组随机选取6只大鼠，使用改良大鼠神经功能缺损评分量表(mNSS)进行神经功能评分[12]，评分结果越高表明神经功能缺损越严重。

1．6TTC染色TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色用于检测大鼠脑梗死情况。随机选取各组大鼠4只，麻醉后断头取脑，脑组织置于冰上，使用大鼠脑模具沿视交叉处进行切片，片厚2 mm，连续切片5片，而后将脑片浸于1% TTC染色液中，37 ℃温箱中浸染20 min，10%福尔马林固定后，各组选取特征性脑片进行拍照分析。使用Image J软件统计各组大鼠脑梗死体积百分比。

1．7Morris水迷宫测试Morris水迷宫测试由定位航行试验与空间探索试验两个部分组成。在训练开始的前 1 d，将各组大鼠在未放置逃生平台的情况下自由游泳60 s。根据训练效果剔出懒惰或过度活跃的大鼠。

1．7．1 定位航行试验：为期6 d，前5 d为训练，第6天测试。水下平台始终固定于同一位置，每天大鼠从迷宫四个象限中部背朝箱壁释入水中。若大鼠在60 s内爬上平台，其找到平台所需时间即为逃逸潜伏时间，若无法到达，将大鼠引导至水下平台上停留15 s，逃逸潜伏时间记录为60 s。

1．7．2 空间探索试验：定位航行试验结束后，于第7天撤除水下平台，将大鼠离水下平台所在位置最远的象限释放入水，记录大鼠在60 s内穿过平台所在位置的次数。

1．8检测海马组织S100β和PGRN蛋白表达水平采用Western bolt技术检测各组大鼠海马组织中S100β和PGRN蛋白表达水平。各组6只大鼠神经功能缺损评分结束后，麻醉断头取脑，脑组织置于冰上使用玻璃分针快速剥离海马组织，投入液氮速冻。配制全蛋白提取液：1 mL冷蛋白裂解液中加入10 μL 100 mmol/L的PMSF、10 μL磷酸酶抑制剂以及1 μL蛋白酶抑制剂混匀，每100 mg组织加入1.5 mL提取液，置于全自动冷冻研磨机中研磨30 s，取出置于4 ℃离心机12 000 r/min离心10 min，吸取上清转入新EP管中，BCA法测定蛋白浓度。配置10%聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样30 μg，80 V恒压30 min，后转为120 V恒压电泳，电泳结束后用湿转法将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入兔抗大鼠S100β单克隆抗体(1∶2 000)、兔抗大鼠PGRN多克隆抗体(1∶200)和兔抗大鼠β-actin单克隆抗体(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗3次，滴加ECL发光液显影成像，测量每张膜的灰度值。

2 结果

2．1mNSS评分与Sham组比较，CIRI组及SEVO组mNSS评分均明显增高(P<0.001)，SEVO组mNSS评分相对于CIRI组明显下降(P<0.001)。见图1。

2．2TTC染色及脑梗死体积百分比CIRI组及SEVO组大鼠梗死体积百分比均明显高于Sham组(P<0.001)，与CIRI组相比，SEVO组大鼠梗死体积百分比明显降低(P<0.001)。见图2。

2．3Morris水迷宫结果1～5 d的训练结果表明，随着训练时间的延长，SEVO组大鼠逃逸潜伏期相对于CIRIC组有所缩短。定位巡航试验中，与Sham组相比，CIRI组大鼠逃逸潜伏期显著延长(P<0.01)；与CIRI组相比，SEVO组大鼠的逃逸潜伏期明显减短(P<0.05)。空间探索试验中，与Sham组相比，CIRI组大鼠穿越平台次数减少，差异有统计学意义(P<0.01)，SEVO组大鼠穿越平台次数则相对于CIRI组有所增加(P<0.05)。见图3。

2．4Westernblot结果与Sham组相比，CIRI组大鼠海马S100β表达明显增加(P<0.01)，SEVO组亦有所增加(P<0.05)，而相对于CIRI组，SEVO组表达则明显降低(P<0.05)。与Sham组相比，PGRN表达量在CIRI组大鼠海马中显著增加(P<0.001)，在SEVO组中也显著增加(P<0.01)，与CIRI组比较，SEVO组表达明显降低(P<0.01)。见图4。

图1 各组大鼠改良神经功能缺损评分比较，****P<0.001 Figure 1 Score results of modified nerve defects in rats in each group．****P<0.001

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是各种缺血性脑血管疾病治疗再通后的常见现象，具体机制尚不明确。目前研究表明CIRI的发生可能与自由基的产生、血脑屏障损伤、氧化应激、炎症及细胞凋亡等有关[13]。再灌注发生后损伤部位被大量的中性粒细胞浸润，致TNF-α、IL-6 和IL-1β等炎性细胞因子大量释放，产生一系列的级联反应，同时大量产生的活性氧自由基与大脑脂质反应产生大量MDA等脂质过氧化物，同时降低超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px等抗氧化酶的活性，从而导致组织氧化与抗氧化系统之间的动态平衡被打破，最终导致脑细胞损伤坏死[14-15]。本研究发现脑缺血再灌注损伤后的大鼠与假手术组相比，神经缺损评分及脑梗死体积百分比均显著升高，同时水迷宫试验表明CIRI组大鼠学习记忆能力与Sham组相比明显下降，表明再灌注损伤可导致大鼠神经功能明显受损，且与学习记忆相关的海马区损伤较为明显。

注：****P<0.001图2 各组大鼠TTC染色及梗死体积百分比 A：Sham组大鼠脑片TTC染色；B：CIRI组脑片TTC染色；C：SEVO组脑片TTC染色；D：梗死体积百分比统计Figure 2 TTC staining and percentage of infarct volume of rats in each group.A：TTC staining of rat brain slices in Sham group；B：TTC staining of rat brain slices in CIRI group；C：TTC staining of rat brain slices in SEVO group；D：statistical result of infarct volume percentage

注：*P<0.05，**P<0.01图3 Morris水迷宫检测大鼠的学习和记忆能力 A：每组大鼠5 d训练的逃避潜伏期；B：定位巡航试验结果；C：空间探索试验结果Figure 3 The Morris water maze measures the learning and memory abilities of rats．A：the escape latency of 5d training for each group of rats；B：experimental results of positioning cruise；C：experimental results of space exploration

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001图4 Western-blot技术检测S100β及PGRN在各组大鼠海马中的表达 A：Western blot条带；B：各组S100β相对表达量；C：各组PGRN相对表达量Figure 4 Western-blot technique was used to detect the expression of S100β and PGRN in the hippocampus of various groups of rats．A：Western blot strip；B：The relative expression level of S100β in each group；C：The relative expression level of PGRN in each group

七氟醚(sevoflurane，SEVO)是一种新型吸入性麻醉剂，具有诱导快、苏醒快、易于控制、呼吸道刺激小、有一定的肌肉松弛等优点，目前在临床麻醉中应用广泛[16-17]。相关研究表明七氟醚在脑、肾、心肌及肺等脏器发生缺血再灌注损伤时均发挥保护作用[18-21]。本研究表明给予七氟醚吸入后处理的CIRI大鼠水迷宫逃逸潜伏期明显缩短，说明七氟醚处理后大鼠的学习能力得到改善，去掉水下平台后SEVO组大鼠在60 s穿越水下平台的次数也显著增加，表明七氟醚后处理大鼠的记忆能力也有所恢复。此外，神经缺损评分结果显示SEVO组大鼠评分相对于CIRI组大鼠明显下降，表明大鼠的神经损伤得到改善，同时TTC染色结果也表明七氟醚后处理的大鼠梗死体积百分比明显降低，脑缺血情况得到改善。

S100β蛋白在CNS主要由星型胶质细胞产生，在少突胶质细胞、神经祖细胞以及外周组织的脂肪细胞、黑色素细胞、皮肤及软骨细胞中亦有少量分泌[22-28]。在生理浓度下S100β可能通过与转录因子产生相互作用而维持正常细胞周期，增强钙通道数量刺激神经生长，刺激星形胶质细胞增殖，促进神经细胞损伤修复。而过量分泌时S100β蛋白会导致细胞功能障碍，在神经细胞变性、炎症反应恶化及神经退行性改变等过程中发挥作用[22-24]。本研究显示，与Sham组相比，CIRI组大鼠S100β表达水平显著增高，七氟醚处理后表达水平则明显降低，表明七氟醚可能通过降低S100β表达水平而发挥神经保护作用。

作为一种神经营养剂，PGRN参与调节大鼠的运动和皮质神经元的生长和细胞凋亡过程[25，29-32]。研究表明PGRN参与缺血缺氧性脑损伤等急性脑损伤过程，使用体外培养的细胞建立氧糖剥夺模型会引起C6细胞系PGRN蛋白表达升高[33-38]。PGRN可能通过抑制炎性反应、减轻血脑屏障的破坏和促进神经保护作用[39-40]。此外，PGRN可通过降低VEGF表达，抑制缺血导致的血管通透性增加，从而发挥神经保护作用[26-30，41-43]。本研究显示，与Sham组比较，CIRI组大鼠PGRN表达水平开始上升，表明机体内的PGRN开始修复受损的神经细胞，七氟醚后处理的大鼠海马PGRN表达进一步升高，同时学习记忆能力得到改善，脑梗死体积缩小，表明七氟醚可能通过调高PGRN的表达参与脑缺血再灌注损伤后损伤神经的修复过程。

本实验通过七氟醚后处理缺血再灌注损伤模型大鼠，表明七氟醚后处理大鼠学习记忆能力得到改善，脑梗死体积有所减小，七氟醚可能通过降低S100β及调高PGRN的水平发挥神经保护作用，本研究为治疗缺血再灌注损伤提供新的思路。