添加残次苹果发酵物对稻草青贮品质及其微生物数量的影响

艾 琪 ，蒋 慧 ※，郭 睿 ，蒋 涛 ，苏华维

（1.塔里木大学动物科学学院，阿拉尔 843300；2.塔里木畜牧科技兵团重点实验室，阿拉尔 843300；3.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；4.动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

0 引 言

2017年国苹果栽培面积为 250.96 万 hm2，比 2016年增加1.73%，总产量达到4 548.40万t，比2016年增长3.65%[1]。伤残烂果率一般为 18%～20%，残次苹果加工利用率不到 20%[2]。苹果产业作为新疆林果业的支柱产业，在新疆经济快速发展过程中发挥着重要作用。2018年，仅南疆阿克苏地区苹果产量就达到了50～60万t[3]。新疆南疆作为偏远地区，因为缺少深加工、运输成本较高、产业链短的现象，严重制约着新疆苹果产业的优化升级，导致残烂果率高于全国平均水平，而残次苹果加工利用率低于全国平均水平，绝大多数残次苹果被抛弃，腐败变质，污染环境，资源浪费相当之大。将残次苹果制作成发酵物，能保存其营养价值以便进一步利用。目前，有关残次苹果发酵物作为反刍动物饲料加工利用方面鲜见报道，大多都是研究苹果渣在反刍动物饲料加工方面的利用[4-6]。

据统计，2015年中国农作物秸秆可收集资源量高达9亿t，稻草可收集量约为1.97 t，其中7.80%的秸秆被直接焚烧，还有19.9%未利用[7-8]。据2018年《新疆统计年鉴》显示，新疆有稻草93.50万t。稻草中含有丰富的粗纤维类碳水化合物，可作为反刍动物重要的粗饲料来源，但稻草营养价值低、适口性差，单纯饲喂很难满足动物的营养需要，其采食量和饲料转化率也很低[9]。近年来有研究发现稻草青贮发酵有助于改善稻草品质，但由于稻草附生乳酸菌较少、可溶性碳水化合物含量低等原因，单一青贮很难获得成功[10]。陈功轩等[11]研究发现饲用苎麻与稻草进行混合青贮之后改善了青贮品质，较好地保持原料的营养特性；全林发等[12]将菠萝皮和稻草混贮，发现添加菠萝皮能够降低混贮的pH值和NH3-N含量，增加了青贮饲料的乳酸含量，添加 20%以上的菠萝皮时效果更佳；Li等[13]添加红薯藤来改善稻草青贮品质，降低了青贮的pH值和NH3-N/TN，提高了青贮的乳酸和乙酸含量；He等[14]将辣木叶和稻草混合青贮，改善了混贮的发酵品质，提高了有氧稳定性。本文将残次苹果发酵物添加在稻草中青贮，可克服稻草可溶性糖含量低的缺陷，希望为青贮发酵提供更充足的发酵底物，获得优良的发酵品质，有利于充分利用新疆本地的农副产品资源。

鉴于以上所述，本研究将不同比例残次苹果发酵物添加于稻草中进行青贮，旨在探索添加残次苹果发酵物改善稻草的青贮品质及其适宜的添加比例，为残次苹果发酵物和稻草的初步利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

残次苹果发酵物是在市场上购买的残次苹果添加本研究团队筛选的几种乳酸菌组合经厌氧发酵而得发酵产物[15]，稻草购买于周边团场。青贮原料的营养成分和微生物数量见表1。

表1 原料营养成分和微生物数量Table1 Nutrient composition and number of microorganisms of raw materials

1.2 试验设计

试验采用完全随机设计，将残次苹果发酵物与稻草按不同质量百分比混合，比例分别为Ⅰ全部为稻草、Ⅱ（1∶9）、Ⅲ（3∶7）、Ⅳ（5∶5）、Ⅴ（7∶3）、Ⅵ（9∶1）共6个处理，每个处理3个重复。

1.3 青贮饲料的调制

将稻草切成2～3 cm 左右的长度，残次苹果发酵物和稻草按试验设计的质量百分比混匀，含水率低的组用自来水调节含水率至 70%左右（以便压实），直接压入洁净的 1 L 玻璃广口瓶中，每组装填浓度分别为Ⅰ：651 g/L、Ⅱ：662 g/L、Ⅲ：698 g/L、Ⅳ：726 g/L、Ⅴ：755 g/L、Ⅵ：788 g/L，盖上盖子后用凡士林和胶带密封，室温下保存。青贮制作时对不同比例混合的原料分别进行取样，用于化学成分分析；90 d 后开盖取样，分析青贮饲料营养成分和发酵品质；同时检测发酵罐开盖后第0、1、3、7、15、30天各处理有氧暴露下 pH值和微生物的数量。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 青贮原料与青贮饲料营养成分的测定

分别称取各混合比例发酵前和发酵后各 500 g 在烘箱中65 ℃ 烘干至恒质量，粉碎后过1 mm筛密封保存备用。干物质（Dry Matter，DM）用 105 ℃ 烘干法测定（DHG-9240A，上海齐欣），粗蛋白质（Crude Protein，CP）采用凯氏定氮法测定，中性洗涤纤维（Neutral Detergent Fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（Acid Detergent Fiber，ADF）含量用范氏洗涤纤维法测定[16]；可溶性碳水化合物（Water Soluble Carbohydrate，WSC）用蒽酮-硫酸比色法测定[17]。

1.4.2 青贮饲料的感官评定、pH值及发酵品质的测定

青贮90 d后，参考续元申等方法进行感官评定[18]。开瓶取出青贮饲料后，在自封袋中混合均匀，准确称取50 g青贮饲料放入1 L 三角瓶中，加2 ℃ 蒸馏水450 mL，用封口膜封口，放入4 ℃ 冰箱中浸提24 h，其间摇晃3～5 次，用涤纶布过滤，并挤尽残渣中的提取液，用定量滤纸过滤，所得提取液保存备用。在提取液中加入 25%的偏磷酸（浸提液与偏磷酸的体积比为 5∶1），静置30 min，在1 500 r/min，4 ℃ 状态下离心15 min，上清液经 0.45μm 滤膜过滤，用高效气相色谱仪测定乳酸、乙酸等含量[19]。pH值用酸度计（PHSJ-5，上海雷磁）测定。氨态氮（NH3-N）用苯酚-次氯酸钠比色法测定[20]。

青贮品质的综合评分：将有机酸占总酸比例的得分和氨态氮占总氮的得分相结合，两者各占50 %，即综合得分=（乳酸得分＋乙酸得分＋丁酸得分）/2＋氨态氮得分[18]。

1.4.3 青贮饲料有氧暴露下微生物数量的测定

青贮90 d 后，青贮饲料开盖后各处理分别在第0、1、3、7、15、30天称取20 g样品，加入180 mL的灭菌水，并做倍比稀释，每个稀释梯度做 3个重复，采用稀释平板涂布法对微生物菌落进行计数[21]。乳酸菌、霉菌、酵母菌分别用MRS培养基、高盐察氏培养基、麦芽糖浸粉琼脂培养基进行培养。

1.5 数据处理

试验数据采用分析软件DPS v3.01专业版和Excel处理，做单因素方差分析，并做Duncan氏法多重比较。

2 结果与分析

2.1 青贮饲料的感官评定

青贮90 d后，通过观察残次苹果发酵物与稻草混贮的色泽、气味、质地等对其进行评分并将各处理的评价结果如图1和表2。处理Ⅰ颜色为黑褐色、有明显的发霉腐烂、质地发黏结块，pH值是 5.03，青贮感官得分20，等级为劣；处理Ⅱ的pH值是4.45，颜色为浅褐色、有淡酸味、质地松软不黏手，青贮感官得分为50，等级为中；处理Ⅲ和处理Ⅳ的 pH值是 4.07、4.01，颜色为亮黄色、甘酸味舒适、质地松软不黏手，青贮感官得分分别是78、80，等级都是优；处理Ⅴ和处理Ⅵ的pH值分别为 3.94、3.43、颜色呈浅褐色和褐黄色、甘酸味舒适、质地松软但黏手，青贮感官得分分别是65、56，等级都是良。

图1 发酵90 d后的残次苹果发酵物和稻草混合青贮外观Fig.1 The appearance of mixed silage with defective apple and rice straw after 90 days fermentation

2.2 混合青贮发酵前、后的营养成分

由表3可知，各混合青贮比例发酵前，处理Ⅰ和处理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的DM含量显著高于处理Ⅴ、Ⅵ（P＜0.05）。发酵后，处理Ⅰ和处理Ⅲ、Ⅳ的 DM 含量差异不显著（P＞0.05），但显著高于处理Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ（P＜0.05）；混合青贮发酵前和发酵后CP含量均随着残次苹果发酵物在青贮中的比例增加而增加，处理Ⅰ的CP含量显著低于Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ这4个处理（P＜0.05）；发酵前和发酵后处理Ⅰ的 NDF、ADF的含量均显著高于其他5个处理（P＜0.05），其他各处理中随着残次苹果发酵物的增加 NDF、ADF的含量逐渐降低；发酵前 WSC含量随着残次苹果发酵物的增加逐渐增加，且各处理之间差异显著（P＜0.05）。发酵后处理Ⅰ的WSC含量显著低于其他各处理Ⅵ（P＜0.05），处理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ之间差异不显著（P＞0.05）。

表2 混合青贮饲料感官评分Table 2 The sensory evaluation of mixed silage

表3 稻草发酵前、后的营养品质Table 3 Nutritional quality of rice straw before or after fermentation %

2.3 混合青贮饲料的发酵品质及综合评价

不同比例残次苹果发酵物与稻草混合青贮发酵品质及综合评价如表4所示。处理Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的乳酸含量差异不显著（P＞0.05），但显著高于处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（P＜0.05）；乙酸含量随着残次苹果发酵物在青贮中的比例增加而增加，处理Ⅰ的AA含量显著低于其他各处理组（P＜0.05）；处理Ⅱ和处理Ⅵ的丙酸含量均为微量，处理Ⅴ丙酸含量最高；处理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ之间的丁酸含量差异不显著（P＞0.05），但显著低于处理Ⅰ和处理Ⅵ（P＜0.05）；处理Ⅰ的 NH3-N/TN的比值显著高于其他 5个处理（P＜0.05）。

由综合评价可知，处理Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的LA/TA比值均高于50%，处理Ⅰ和处理Ⅱ的LA/TA比值分别为22.37%、30.38%；AA/TA的比值随着残次苹果发酵物的增多而升高，处理Ⅵ的AA/TA的比值最高（36.10%）；处理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的BA/TA比值均低于4%，处理Ⅰ的BA/TA比值最高（28.95%）；各处理综合得分分别为37.5、76.0、94.5、95.0、90.5、85.0，处理Ⅳ的得分最高。

2.4 有氧暴露后pH值和微生物数量的变化

pH值的变化如图2所示。有氧暴露期间，处理Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的pH值上升缓慢，且差异不显著（P＞0.05），但显著低于处理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ（P＜0.05）；并且随着有氧暴露时间的延长，各处理的 pH值逐渐升高，在有氧暴露第30 天时各处理的pH值均达到最高。

乳酸菌的数量随着有氧暴露时间的延长而减少；在有氧暴露的0～30 d内，处理Ⅰ的乳酸菌数量均显著低于其他5个处理（P＜0.05）；处理Ⅰ和处理Ⅵ的乳酸菌数量减少的幅度较大。到有氧暴露第 30 天 时处理Ⅰ的乳酸菌数量显著低于其他5个处理（P＜0.05），处理Ⅳ的乳酸菌数量最多。

酵母菌数量变化随着有氧暴露时间的延长而增多，处理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的酵母菌数量增多的幅度较大；在有氧暴露第0～7天，处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ酵母菌的数量迅速增长，以后增长缓慢，处理Ⅳ的酵母菌数量增加缓慢，并显著低于其他处理（P＜0.05）；当有氧暴露 30 d时，处理Ⅰ的酵母菌数量仍显著高于其他各处理（P＜0.05），处理Ⅵ的酵母菌数量最少。

霉菌数量随着有氧暴露时间的延长逐渐增多，处理Ⅰ和Ⅵ的霉菌数量显著高于其他处理（P＜0.05）；处理Ⅲ、Ⅳ的霉菌数量最低，显著低于其他几个处理（P＜0.05）。

图2 有氧暴露过程中混合青贮pH值和微生物数量的变化Fig.2 Changes of pH value and microbial quantity in mixed silage during oxygen exposure

3 讨 论

3.1 添加比例对感官品质的影响

感官评价是通过青贮的色泽、质地、气味等来进行初步评价青贮是否成功[22]。优质青贮饲料颜色应与青贮原料颜色相近，气味酸醇有芳香，质地柔软稍湿润，且无霉变发生[23]。本试验结果发现，稻草单一青贮90 d后，有明显腐烂且有霉味，说明稻草单独青贮不成功。而添加了残次苹果发酵物的处理Ⅱ～Ⅳ青贮90 d后，由淡酸味变为甘酸味，颜色由褐黄色变为亮黄色；在质地方面，松散柔软不黏手，说明添加残次苹果发酵物可以改善稻草青贮的感官品质。处理Ⅴ和处理Ⅵ颜色较深，发黏结块，这可能是由于加入残次苹果发酵物比例较高使得青贮水分含量过高造成的。感官评分中显示添加残次苹果发酵物与稻草的比例在3:7～5:5之间感官评分最高。

3.2 添加比例对稻草青贮营养成分的影响

青贮是否成功主要受原料糖分含量、水分及压实程度的影响[24]。本研究中稻草的水分少、WSC含量低，单独青贮品质差；而单一的残次苹果发酵物水分高达92.12%，WSC的含量达到了15.56%，能够弥补稻草青贮水分少、WSC含量低的不足。本试验中，随着稻草青贮中添加残次苹果发酵物比例的增加，青贮原料的 CP和WSC含量增加，为青贮微生物发酵提供了丰富的底物，是添加残次苹果发酵物改善稻草青贮品质的原因之一。这与罗颖洁等[25]通过添加麦麸增加青贮原料中的 CP和WSC含量改善稻秸与苜蓿混贮品质；李君临等[26]添加多花黑麦草增加稻草混贮中的CP和WSC改善二者的混贮品质的效果一致。

3.3 添加比例对稻草青贮发酵品质的影响

pH 值是青贮饲料是否发酵成功的重要指标之一，品质优良的青贮饲料pH值应在3.8～4.2之间，发酵时pH值越低，青贮饲料越容易保存[27]。pH值低于4.6时，蛋白质较稳定，只有少部分被分解；pH值高于4.6时，腐败菌、梭菌等杂菌的含量增多青贮饲料的蛋白质进一步被分解，营养成分损失较多[28]。有研究报道，青贮饲料低pH值能够抑制蛋白酶的活性，减少蛋白质的降解，而且还可以抑制对青贮有害的细菌生长，保障青贮品质[29]。由本试验结果可知，单一稻草青贮的pH值是5.03，随着残次苹果发酵物的增多混贮饲料的pH值在逐渐降低，最低为 3.43，说明添加残次苹果发酵物能降低混合青贮饲料的pH值，抑制有害微生物的繁殖。

有研究表明，青贮饲料在乳酸菌作用下，发酵饲料中的营养物质生成大量有机酸，使青贮饲料的 pH值降低，抑制有害微生物，使乳酸菌成为青贮的优势菌群[30]。在青贮饲料中乳酸含量越高，pH值也就越低，青贮以乳酸发酵为主，青贮质量也就越好[31]。孙雨坤等[32]的研究表明，添加苹果渣可以弥补苜蓿青贮所需的可溶性碳水化合物，降低了pH值，乳酸含量增加并抑制了其他有害微生物的繁殖。本试验表明，随着残次苹果发酵物添加比例的增多，乳酸和乙酸含量也逐渐增多，而丁酸含量呈减少的趋势。这就说明添加残次苹果发酵物的稻草青贮改善了稻草的发酵品质。虽然处理Ⅴ和处理Ⅵ的乳酸和乙酸含量比其他几个处理都有都高，但丁酸含量也较高，这有可能是因为处理Ⅴ和处理Ⅵ中水分较多干物质较少导致的。并且综合评分从低到高的顺序为ⅣⅢⅤⅥⅡⅠ，这与感官评价的结果一致。

NH3-N/TN被广泛用于衡量青贮饲料发酵品质的好坏，其比值越大，说明被分解的蛋白质和氨基酸越多，青贮质量就越差，优质青贮饲料的NH3-N/TN含量应低于10%[33-34]。本试验中，单一稻草青贮（处理Ⅰ）的处理NH3-N/TN高达 16.28%，说明发酵品质差；其他各处理NH3-N/TN比值均低于10%，达到优良青贮饲料的要求，表明添加残次苹果发酵物能降低蛋白质的降解，更好保存饲料营养物质。发酵产物的综合评分中显示添加残次苹果发酵物与稻草的比例在3:7～5:5之间综合评分最高。

3.4 添加比例对稻草青贮有氧暴露 pH值和微生物的动态变化

青贮饲料在有氧暴露情况下，好氧性微生物就会利用青贮中的养分进行繁殖，酵母菌和霉菌数量增多，乳酸菌受抑制而数量减少，使得青贮饲料的pH值上升，有氧稳定性差[35]。本试验中，有氧暴露期间，处理Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的pH值上升幅度缓慢，处理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的pH值上升幅度较快。表明不添加残次苹果发酵物（Ⅰ）、添加过少（Ⅱ）或过多（Ⅵ）青贮饲料有氧稳定性差。

有研究发现，在有氧暴露情况下乳酸菌数量逐渐减少，而酵母菌和霉菌等好气性微生物因条件适宜而大量繁殖，导致青贮饲料营养损失并腐败[36-37]。在本试验中，有氧暴露后处理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的乳酸菌数量减少的幅度较大，而酵母菌数量增多的幅度较大，处理Ⅳ的乳酸菌保留最多，处理Ⅰ和Ⅵ的霉菌数量显著高于其他处理（P＜0.05）；处理Ⅲ、Ⅳ的霉菌数量最低。这表明处理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的有氧稳定性差，处理Ⅲ、Ⅳ的有氧稳定性较好。各处理的乳酸菌数量均随着有氧暴露时间的延长而逐渐减少，酵母菌和霉菌的数量随着时间的延长逐渐增多，这与Spadaro等[38]和王旭哲等[39]的研究有相似的结果。处理Ⅴ和处理Ⅵ的酵母菌和霉菌数量增加幅度较大，这可能是因为残次苹果发酵物水分、可溶性碳水化合物含量较高，添加残次苹果发酵物比例越高混贮中水分和可溶性碳水化合物含量就越高。在有氧暴露情况下，酵母菌和霉菌等好气性微生物更易大量繁殖有关，这与周瑞等[40]将甜菜块根和玉米秸秆混贮的结果一致。

4 结 论

1）添加残次苹果发酵物能显著提高（P＜0.05）单一稻草青贮的可溶性碳水化合物和粗蛋白的含量。

2）添加残次苹果发酵物能显著提高（P＜0.05）稻草青贮的乳酸和乙酸含量，降低 pH值、丁酸含量和NH3-N/TN的比值，改善青贮的感官品质和发酵品质。

3）添加残次苹果发酵物与稻草的比例在3:7～5:5之间适宜。