NAA、IAA与鱼肉蛋白酶解物对小球藻生长和抗氧化能力的影响

赵子续 张宝龙 曲 木 唐子鹏 翟胜利

天津现代晨辉科技集团有限公司/天津市水族动物功能性饲料企业重点实验室，天津301800

植物激素又称植物内源激素，指植物体内产生的一些微量并能调节自身生理活动过程的小分子有机化合物，共分为生长素、乙烯、脱落酸、赤霉素、细胞分裂素和油菜素甾醇六类。其中，生长素是第1个被发现的植物激素，吲哚乙酸（IAA）为其重要的化学物质，具有促进植物生长的作用。而作为生长素类似物的萘乙酸（NAA）在植物生长过程中具有重要的调节作用，二者在农业生产上应用广泛。陈颖等[1]研究表明，植物激素对螺旋藻的生长和代谢产物的合成有明显的促进作用。

在水产养殖中，一些低值鱼类被简单地加工成经济效益极低的饲料鱼粉，由于加工和回收手段的落后导致营养物质大量流失，产品使用价值较低。因此，提高低值鱼类的利用价值具有重要的研究意义。酶解法具有操作方便、对营养物质破坏小等优点，被广泛应用于动物蛋白的回收。何建君等[2]研究表明，鱼蛋白经酶降解后，功能和品质得到了显著提高。

小球藻（Chlorella vulgaris）隶属于绿藻门，小球藻属，是一种单细胞淡水藻类，具有生长速度快、易于培养、营养丰富等优点。在水产养殖中，常作为轮虫、桡足类等强化培育饵料，也可作为鱼类的开口饵料，具有很高的应用价值。罗川等[3]研究表明，在小球藻培养基中添加2 种植物激素，小球藻生长及脂质合成影响显著。叶林超等[4]研究表明，动物蛋白酶解物与氮、磷的组合能显著提高小球藻的生物量，促进叶绿素和藻体蛋白质的合成。而研究植物激素和动物蛋白酶解物相结合对小球藻的影响却鲜有报道。本试验中研究了2 种植物激素（NAA、IAA）和动物蛋白酶解物之间的不同组合对小球藻生长和生理生化的影响，旨在为植物激素和动物蛋白酶解物在藻类生长的研究提供方法，为小球藻的深入研究和大规模生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

藻种来源：中国科学院水生生物研究所购买藻种（普通小球藻FACHB-1227），在天津现代晨辉科技集团有限公司研发中心实验室扩培至30 L 以试验备用，测得其吸光度为0.640。

以BG11 培养基[5]为小球藻基础培养基，其营养盐成分主要由NaNO3、K2HPO4和MgSO4·7H2O 等组成。各营养盐的添加量及A5 组成见表1和表2，调节其pH 为7.5～8.0，测得其吸光度为0.011。

1.2 试验方法

1）蛋白酶解物的制取。取适量经绞碎的新鲜鱼肉，1∶1 加水充分搅拌，按500∶1 添加枯草杆菌酶，一定温度下水浴酶解3 h 后，90 ℃灭酶15 min，水浴冷却，5 000 r/min 离心10 min，取上清液[6]。

2）试验设计。本试验以NAA、IAA 和蛋白酶解物为影响因素，进行三因素三水平正交试验[7]，研究不同浓度（0.5、2.0、3.5 mg/L）NAA、IAA 和（0.05、0.20、0.35 mL/L）蛋白酶解物对小球藻生长及营养含量的影响；比较不同添加剂的不同添加量对小球藻生长的诱导效果。小球藻藻种与添加相应植物激素和蛋白酶解物的BG11 培养基按1∶3 的比例扩培，测得初始小球藻吸光度为0.145±0.006。正交试验因素水平见表3。

3）培养条件。试验采用混养模式，将培养瓶置于光照培养箱培养，光照3 000～4 000 lx，光暗周期为12 h∶12 h，温度25～30 ℃，每组设置3 个平行[8]，培养周期为10 d。

表1 小球藻BG11 培养基组成

表2 A5 试剂的组成

表3 NAA、IAA 与蛋白酶解物组合的正交试验设计

4）试验测定。

①生长指标测定

A.吸光度：试验开始时，采用分光光度计于波长680 nm 测定不同植物激素添加量的小球藻液的吸光度值，并在培养期间每天测1 次吸光度，测定小球藻的繁殖速度。

B.细胞密度：采用0.1 mL 计数框计数，取稀释后的小球藻液0.1 mL 于浮游植物计数框，在生物显微镜（400～600 倍）下，选取5 个视野观察计数；每个水样计数2 次，取其平均值，把计数所得结果换算为原来水样中藻类的数量时，用下式计算：

N=1000×10×20 n×A

式中：

N——1 L 原水样中浮游植物数量（个/L）；

n——计数所得每次计数框藻类的平均数量；

A——稀释倍数。

C.比生长速率（μ）[9]：μ=（lnNt-lnN0）/T

式中，Nt 和N0分别为经过T 天后细胞密度和初始细胞密度。

②生化指标测定。

试验周期结束以后，准确称取小球藻组织湿重，按重量（g）∶体积（mL）=1∶4 的比例，加入4 倍体积的PBS 缓冲液，冰水浴条件下匀浆，3 500 r/min，离心10 min，取上清液稀释成相应的浓度用于生化指标的测定。蛋白质定量、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）均采用试剂盒测定，购于南京建成生物工程研究所。

5）数据分析。采用Excel 对数据进行分析，试验数据以“平均值±标准差（mean±SD）”表示。采用SPSS 18.0 统计分析软件进行单因素方差分析，若差异性显著（P<0.05）则进行Duncan’s 多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 对小球藻生长指标的影响

1）对小球藻吸光度的影响。植物激素与动物蛋白酶解物的不同组合对小球藻生长的影响从图1可知，在试验周期内，小球藻培养基中添加相应的不同植物激素和蛋白酶解物，小球藻吸光度的变化范围为0.673～0.821。各组之间小球藻吸光度差异显著（P<0.05）。4 组（NAA 0.5 mg/L、IAA 3.5 mg/L、蛋白酶解物0.35 mg/L）和6 组（NAA 2.0 mg/L、IAA 2.0 mg/L、蛋白酶解物0.35 mg/L）小球藻的吸光度较高，分别为0.821±0.010 和0.802±0.009，且2 组之间小球藻吸光度无显著性差异（P>0.05）。9 组（NAA 0.5 mg/L、IAA 0.5 mg/L、蛋白酶解物0.05 mg/L）小球藻的吸光度较低，为0.673±0.011，9 组比4 组降低了18.03%。基于小球藻吸光度的评价，4 组和6组小球藻的生长状况较好。

图1 植物激素与动物蛋白酶解物的不同组合对小球藻比生长速率的影响

2）对小球藻比生长速率的影响。植物激素与动物蛋白酶解物的不同组合对小球藻比生长速率的影响如图2所示，在试验周期内，小球藻培养基中添加相应的不同植物激素和蛋白酶解物，小球藻比生长速率的变化范围为0.153～0.173/d。各组之间小球藻比生长速率差异显著（P<0.05）。4 组（NAA 0.5 mg/L、IAA 3.5 mg/L、蛋白酶解物0.35 mg/L）和6 组（NAA 2.0 mg/L、IAA 2.0 mg/L、蛋白酶解物0.35 mg/L）小球藻的比生长速率较高，分别为0.173/d 和0.171/d，且2 组之间小球藻比生长速率无显著性差异（P>0.05）。9 组（NAA 0.5 mg/L、IAA 0.5 mg/L、蛋白酶解物0.05 mg/L）小球藻的比生长速率较低，为0.153/d，9 组比4 组降低了11.56%。基于小球藻比生长速率的评价，4 组和6 组小球藻的生长速率较快。

图2 植物激素与动物蛋白酶解物的不同组合对小球藻生长的影响

2.2 植物激素与蛋白酶解物对小球藻生化指标影响的正交分析

1）植物激素与蛋白酶解物对小球藻总蛋白浓度的正交分析。由表4正交分析结果可知，3 因素对小球藻总蛋白浓度的影响有显著性差异（P<0.05）。3个因素的极差表现为蛋白酶解物>IAA>NAA，说明3 种因素对小球藻总蛋白浓度的影响大小依次为蛋白酶解物>IAA>NAA。从各因素不同水平间的差异来看，不同NAA 浓度下总蛋白浓度的大小为A3（3.5 mg/L）>A2（2.0 mg/L）>A1（0.5 mg/L）；不同IAA浓度下总蛋白浓度的大小为B3（3.5 mg/L）>B2（2.0 mg/L）>B1（0.5 mg/L）；不同蛋白酶解物下总蛋白浓度的大小为C3（0.35 mL/L）>C2（0.20 mL/L）>C1（0.05 mL/L）。说明各因素的水平差异会对小球藻总蛋白浓度造成影响。

从各处理间的比较来看，小球藻总蛋白浓度较高的为8 组（A3B3C2）和4 组（A1B3C3），分别为147.33±3.59 μg/mL 和143.11±4.78 μg/mL，小球藻总蛋白浓度最低的为9 组（A1B1C1），为110.97±4.70 μg/mL。9 组比8 组和4 组分别降低了24.70%、22.46%。说明各因素不同水平的不同组合对小球藻总蛋白浓度有较大影响。从各因素的最优水平来看，小球藻总蛋白浓度的最优组合为A3B3C3，即NAA 浓度为3.5 mg/L、IAA 浓度为3.5 mg/L、蛋白酶解物0.35 mL/L。

2）植物激素与蛋白酶解物对小球藻总SOD 活力的正交分析。由表5正交分析结果可知，3 因素对小球藻总SOD 活力的影响有显著性差异（P<0.05）。3个因素的极差表现为蛋白酶解物>IAA>NAA，说明3 种因素对小球藻总SOD 活力的影响大小依次为蛋白酶解物>IAA>NAA。从各因素不同水平间的差异来看，不同NAA 浓度下总SOD 活力的大小为A3（3.5 mg/L）>A2（2.0 mg/L）>A1（0.5 mg/L）；不同IAA 浓度下总SOD 活力的大小为B3（3.5 mg/L）>B1（0.5 mg/L）>B2（2.0 mg/L）；不同蛋白酶解物下总SOD 活力的大小为C3（0.35 mL/L）>C2（0.20 mL/L）>C1（0.05 mL/L）。说明各因素的水平差异会对小球藻总SOD 活力造成影响。

从各处理间的比较来看，小球藻总SOD 活力较高的为4 组（A1B3C3）和8 组（A3B3C2），分别为86.75±3.14 U/mg 和86.53±2.28 U/mg，小球藻总SOD 活力最低的为9 组（A1B1C1），为63.66±1.83 U/mg。9 组比4 组和8 组分别降低了26.62%和26.43%。说明各因素不同水平的不同组合对小球藻总SOD 活力有较大影响。从各因素的最优水平来看，小球藻总SOD 活力的最优组合为A3B3C3，即NAA 浓度为3.5 mg/L、IAA 浓度为3.5 mg/L、蛋白酶解物0.35 mL/L。

表4 小球藻总蛋白浓度正交试验结果

3）植物激素与蛋白酶解物对小球藻CAT 活力的正交分析。由表6正交分析结果可知，3 因素对小球藻CAT 活力的影响有显著性差异（P<0.05）。3 个因素的极差表现为蛋白酶解物>IAA>NAA，说明3 种因素对小球藻CAT 活力的影响浓度下CAT 活力的大小为A3（3.5 mg/L）>A2（2.0 mg/L）>A1（0.5 mg/L）；不同IAA 浓度下CAT 活力的大小为B3（3.5 mg/L）>B2（2.0 mg/L）>B1（0.5 mg/L）；不同蛋白酶解物下CAT 活力的大小为C3（0.35 mL/L）>C2（0.20 mL/L）>C1（0.05 mL/L）。说明各因素的水平差异会对小球藻CAT 活力造成影响。

从各处理间的比较来看，小球藻CAT 活力较高的为8 组（A3B3C2）和4 组（A1B3C3），分别为5.86±0.07 U/mg 和5.25 ±0.10 U/mg，小球藻CAT 活力最低的为9 组（A1B1C1），为3.32±0.08 U/mg。9 组比8组和4 组分别降低了43.34%、36.76%，说明各因素不同水平的不同组合对小球藻CAT 活力有较大影响。从各因素的最优水平来看，小球藻CAT 活力的最优组合为A3B3C3，即NAA 浓度为3.5 mg/L、IAA浓度为3.5 mg/L、蛋白酶解物0.35 mL/L。

4）植物激素与蛋白酶解物对小球藻MDA 含量的正交分析。由表7正交分析结果可知，3 因素对小球藻MDA 含量的影响有显著性差异（P<0.05）。3 个因素的极差表现为蛋白酶解物>IAA>NAA，说明3种因素对小球藻MDA 含量的影响大小依次为蛋白酶解物>IAA>NAA。从各因素不同水平间的差异来看，不同NAA 浓度下MDA 含量的大小为A3（3.5 mg/L）>A2（2.0 mg/L）>A1（0.5 mg/L）；不同IAA 浓度下MDA 含量的大小为B3（3.5 mg/L）>B2（2.0 mg/L）>B1（0.5 mg/L）；不同蛋白酶解物下MDA 含量的大小为C3（0.35 mL/L）>C2（0.20 mL/L）>C1（0.05 mL/L）。说明各因素的水平差异会对小球藻MDA 含量造成影响。

从各处理间的比较来看，小球藻MDA 含量较低的为4 组（A1B3C3）和8 组（A3B3C2），分别为0.69±0.04 nmol/mg 和0.74±0.03 nmol/mg，小球藻MDA 含量最高的为9 组（A1B1C1），为1.07±0.07 nmol/mg。9 组比4 组和8 组分别升高了35.51%和30.84%，说明各因素不同水平的不同组合对小球藻MDA 含量有较大影响。从各因素的最优水平来看，小球藻MDA 含量的最优组合为A3B3C3，即NAA浓度为3.5 mg/L、IAA 浓度为3.5 mg/L、蛋白酶解物0.35 mL/L。

表5 小球藻总SOD 活力正交试验结果

表6 小球藻总CAT 活力正交试验结果

表7 小球藻MDA 含量正交试验结果

3 讨 论

3.1 植物激素、蛋白酶解物对小球藻生长的影响

植物激素在促进植物生长、提高生物量等方面作用显著[10-11]。对植物体的生长发育有多方面的影响，是植物生存所必需的内生激素，至今还未发现有离开生长素而独立存在的突变体[12]。天然提取激素吲哚-3-乙酸（IAA）和人工合成类似激素1-萘乙酸（NAA）在农业生产中是较为成熟的2 种植物激素[13]。有研究表明，生长素在微藻中的作用与植物相似，在藻类培养基中添加适量浓度的IAA 不仅促进部分单细胞藻类的生长，还对促进细胞分裂，提高藻类生物量有显著影响[14-16]。此外，也有利用人工合成类似物NAA 来诱导藻类产生更多生长素从而促进其生长[17]。动物蛋白酶解物主要是一些小分子肽，饲料中添加一些小分子肽有助于矿物质的利用率，促进体内蛋白质的合成[18]。叶林超[19]研究氮、磷源与蛋白酶解物的营养组合对小球藻增殖机理和缢蛏生长影响，表明添加N 50 mg/L、P 4 mg/L、蛋白酶解物12 mL/L 能显著促进小球藻的生长。罗川等[3]研究表明1～2 mg/L 的IAA 和0.05～2 mg/L 的NAA表现为促进小球藻生长，而高浓度（5 mg/L）表现为抑制生长。试验结果表明，4 组（NAA 0.5 mg/L、IAA 3.5 mg/L、蛋白酶解物0.35 mL/L） 和6 组（NAA 2.0 mg/L、IAA 2.0 mg/L、蛋白酶解物0.35 mL/L）小球藻的生长状况及生长速率较快，与叶林超[19]和罗川等[3]的研究结果相似。

3.2 植物激素、蛋白酶解物对小球藻生化指标的影响

小球藻所含粗蛋白含量可达50%以上，必需氨基酸比例平衡，是作为蛋白质补充饲料的理想选择[20]。SOD、CAT 均为抗氧化酶，是机体清除活性氧保护细胞免受氧化损伤的重要屏障[21]。MDA 的高低间接反映了机体细胞免受自由基攻击的严重程度。本试验结果表明，小球藻培养基添加植物激素和蛋白酶解物对小球藻的生化指标影响差异显著（P<0.05）。4 组A1B3C3 和8 组A3B3C2 的酶活力较高且能降低MDA 的含量。

4 结 论

试验表明，NAA、IAA 和蛋白酶解物存在一定的互作效应，能有效地提高小球藻的生长状况和生长速率。基于小球藻的吸光度和比生长速率评价，4 组（NAA 0.5 mg/L、IAA 3.5 mg/L、蛋白酶解物0.35 mL/L）和6 组（NAA 2.0 mg/L、IAA 2.0 mg/L、蛋白酶解物0.35 mL/L）小球藻的生长状况和生长速率优于其他7 组。

正交试验结果表明，3 因素对小球藻生化指标的影响有显著性差异（P<0.05），对小球藻生化指标的影响大小均为蛋白酶解物>IAA>NAA。从各处理间的比较来看，小球藻较高的酶活力和较低的MDA含量均为8 组A3B3C2 和4 组A1B3C3，9 组A1B1C1 酶活力较低且MDA 含量较高。从各因素的最优水平来看，小球藻生化指标的最优组合为A3B3C3，即NAA 浓度为3.5 mg/L、IAA 浓度为3.5 mg/L、蛋白酶解物0.35 mL/L。在实际生产中，为了促进小球藻的生长和营养物质的积累，要考虑最优的组合及适宜浓度的添加量。由于本试验设计的植物激素和蛋白酶解物的添加量梯度较小，对于植物激素和蛋白酶解物对小球藻生长的最优化还有待进一步研究。