稻城县牦牛轮状病毒感染情况的检测

何宗伟，张 敏，李有智，叶忠明，吴建平，刘怡雯，杨丹娇通信作者

(1.稻城县农牧农村和科技局，四川 稻城 627750；2.甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所，四川 康定 626000)

0 引言

近几年发现，牦牛随着环境的恶化，各种疾病的发病率也随之增加[1]。其中以牦牛腹泻最为常见。犊牛腹泻一直是困扰牦牛养殖业的重要问题[2]。腹泻是造成犊牦牛生长发育不良、死亡的疾病之一，给养牛业造成了重大的经济损失。引起牛腹泻的常见病毒有牛轮状病毒(bovinerotavirus，BRV)、牛冠状病毒(bovinecoronavirus，BccoV)和牛病毒性腹泻(bovineviraldiarrh-eavirus，BVDV)。有报道显示BRV在不同的国家和地区均呈现地方性流行[3]。

有近50%的新生犊牛腹泻与轮状病毒感染有关[4]。为调查稻城牦牛腹泻病毒BRV感染情况，进行了相关检测。

1 材料

1.1 样本采集

试验待检样本于2019年5月采自四川省稻城县5个不同乡镇的牦牛场。 采样后-80℃保存备用。

1.2 试剂和主要仪器

试剂：DNA Marker Ⅱ、Marker DL2000(北京天根公司)，2×Taq PCR Master Mix(擎科公司)；RNAiso Plus、PrimeScriptTM等全部从宝生物工程(大连)股份有限公司采购。凝胶成像仪(Universal Hood Ⅱ， BIO-RAD公司)，高速离心机(5801，Eppendorf公司)，电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)，PCR 仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 核酸的提取

样本送至实验室后，提取样本总RNA(根据Trizol Reagent说明书)，随后进行cDNA的合成(按照反转录试剂盒说明书)-20℃保存备用。

2.2 RT-PCR检测BRV

检测BRV的RT-PCR方法参考周芳等[5]对牛轮状病毒RT-PCR的建立方法；所有引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成，引物信息，如表1所示。

表1 BRV检测引物

反应体系为：2×PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，dH2O 8.5 μL，总体积25 μL。

3 结果

RT-PCR检测轮状病毒的电泳结果显示：在PCR扩增产物电泳中扩增出约230 bp的条带，为牦牛BRV特异条带，部分电泳结果，如图1所示。

图1 部分牦牛BRV扩增结果

检测结果：在46分腹泻粪便样本中，检测出BRV的阳性样本16份，阳性率为34.78%。

4 讨论

本实验对稻城县5个不同乡镇的46份不同牦牛粪便样本进行了BRV 感染情况的检测，结果显示，BRV的阳性检出率为34.78%。该结果表明稻城县部分地区牦牛存在BRV的感染情况，而BRV是严重危害牦牛犊牛健康的一种腹泻病毒。有调查显示，BRV在云南、青海、西藏和四川的牦牛腹泻样本的感染率分别为90%、95%、60%和 85.19%，如此高的感染率证明了BRV是引起青藏高原牦牛腹泻的重要病原[5]。BRV主要感染刚出生的犊牛，BRV感染犊牛机体后，抵抗力减弱，细菌在此时极易侵入机体，造成感染，加重了病情，导致死亡率升高[4]。犊牦牛腹泻是临床上最为常见的多发病，也是影响犊牦牛存活率的主要因素之一。因此，防治犊牦牛腹泻变得尤为重要。但到目前为止还没有针对防治牦牛BRV十分可靠、安全的疫苗[6]。

在没有特异性疫苗的情况下，应该进行预防为主的综合性预防措施。具体措施包括：死畜尸体无害化处理，根除传染源；消毒彻底，切断病毒传播途径；隔离病畜，积极治疗，减少经济损失；设置防治组，层层实行责任制；加强技术培训，提高各级防治队伍的技术水平；进行大力宣传，开展群防群治[7]。