HPLC 法测定人血浆中奥卡西平活性代谢产物单羟基卡马西平的浓度

姚囡囡，周 宇，付文倩，黄 珊，宋洪涛 （中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院药学科，福建 福州 350025）

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；H1850R 型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DHG-9145A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科仪器有限公司）；SHBB95A 型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；Discovery DV215CD 型分析天平（美国OHAUS 公司）；Vortex-5 型涡旋混合器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.2 材料

MHD 对照品（美国CATO 公司）；内标：奥硝唑（中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海科丰化学试剂有限公司）；空白血浆（医院血库提供）；超纯水（实验室自制）。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），预柱为Eclipse XDB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈（80:20，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μl；双波长检测：在192 nm 处检测MHD，318 nm 处检测奥硝唑。

2.2 溶液及血浆样品的配制

2.2.1 储备液的配制

精密称取MHD 对照品10 mg 于10 ml 的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为1 mg/ml 的储备液，置于-20 ℃下保存。

2.2.2 内标工作液的配制

精密称取奥硝唑1.4 mg 于10 ml 的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为140 μg/ml 的内标工作液，置于-20 ℃下保存。

2.2.3 血浆标准曲线和质控样品的配制

多风电场无功优化问题,即包括海上风电场在内的各个风电场利用风机自身无功调节能力及无功补偿设备,如高压并联电抗器(以下简称“高抗”),实现对区域电网内无功功率的优化调节,从而达到提高区域电网节点电压质量和减少网络损耗的目的。崇明岛、北支厂址两个海上风电场所采用的无功补偿方式为固定高抗和可投切高抗联合补偿的方式,能够灵活调节输出无功功率[9]。

分别精密量取适量储备液，用甲醇稀释成20、50、100、200、300、400、500 μg/ml 浓度梯度的标准对照溶液。取以上6 个标准对照溶液，加入适量空白血浆，得2、5、10、20、30、40、50 μg/ml 系列浓度的血浆标准曲线样品。同法配制相应的低、中、高浓度的血浆质控样品（QC），使得MHD 对应的浓度分别为5、15、40 μg/ml。

2.3 血浆样品的预处理

取200 μl 血浆样品，加入200 μl 内标工作液、400 μl 甲醇，涡旋混合30 s，10 ℃条件下13 000 r/min离心10 min，取上清液直接进样。

3 结果

3.1 专属性试验

通过考察6 份不同生物来源的空白血浆样品色谱图、空白血浆样品加入MHD 对照品和内标的色谱图，以及临床实际用药后的患者血浆样品色谱图，以此反映方法的专属性。由图1 可见，在本实验条件下，被测物MHD 与内标的色谱峰分离良好，且血浆中的内源性物质不干扰测定。MHD 和内标的保留时间分别为9.5 min 和6.1 min。

图1 奥卡西平代谢产物单羟基卡马西平的HPLC 图

3.2 标准曲线与线性范围

取上述浓度为2、5、10、20、30、40、50 μg/ml的血浆标准曲线样品按“2.3”项下方法处理。经HPLC 法分析，以测得OXC 的峰面积与内标峰面积之比（Y）作为纵坐标，以血浆MHD 浓度（X）为横坐标，得到回归方程为：Y=0.047 1X+0.022 2（r=0.998 6）。线性范围：根据标准曲线，MHD 血药浓度在2～50 μg/ml 范围内线性关系良好，其定量下限浓度为2 μg/ml。

3.3 日内、日间精密度和准确度

配制定量下限、低、中、高（2、5、15、40 μg/ml）4 种浓度的QC 样品各6 个，按“2.3”项下方法处理后测定，连续测定3 d，以当天的标准曲线计算QC 样品的测定浓度，计算日内、日间精密度以及准确度。经测定，MHD 的日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，均符合生物样品的测定要求，结果见表1。

表1 单羟基卡马西平日内、日间精密度和准确度（n=6）

3.4 提取回收率

配制低、中、高（5、15、40 μg/ml）3 种浓度的QC 样品各6 个，按“2.3”项下方法处理。同时另取18 份空白血浆，除了不加系列对照品溶液和内标外，按“2.3”项下方法处理，在获得的上清液中加入MHD 和内标溶液至相应浓度。进样分析，以每一浓度中2 种不同处理方法的峰面积比值计算提取回收率。经测定，本法中MHD 的平均提取回收率在89.62%～95.32%之间；内标的平均提取回收率为98.76%，符合生物学样品的分析要求，结果见表2。

表2 单羟基卡马西平、MHD 和内标提取回收率试验结果（n=6）

3.5 稳定性试验

3.5.1 室温稳定性试验

取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3 种浓度的QC 样品各5 份，测定即时血药浓度，并在室温条件下放置4 h 和10 h 后测定样品血药浓度，求得RSD 和RE 值。经测定MHD 血浆样品在室温下放置10 h 后仍稳定，RSD 均小于4.47%，RE 值在1.50%～2.98%之间，结果见表3。

表3 奥卡西平代谢产物单羟基卡马西平稳定性试验结果 (n=5)

3.5.2 冻融稳定性试验

取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3 种浓度的QC 样品各5 份，测定即时血药浓度，并于-20 ℃冰箱中冷冻保存24 h 后室温下解冻1 h 后测定，反复冻融3 次，求得RSD 和RE 值。经测定MHD 血浆样品反复冻融3 次后仍能保持稳定，RSD 均小于2.83%，RE 值在1.86%～9.41%之间，结果见表3。

3.5.3 处理后的血浆样品在自动进样器中储存的稳定性试验

取低、中、高3 个浓度水平的血浆QC 样品（5、15、40 μg/ml）各5 份，测定即时血药浓度，然后放置在自动进样器内12 h、36 h 后再次测定，求得RSD 和RE 值。经测定处理后的MHD 血浆样品在进样器内放置36 h 仍能保持稳定，RSD 均小于5.09%，RE 值在-1.34%～7.74%之间，结果见表3。

3.5.4 长期稳定性试验

取低、中、高3 个浓度水平的血浆质控样品（5、15、40 μg/ml）各5 份，测定即时血药浓度，并置于-20 ℃冰箱中冻存30 d 后取出解冻后测定，求得RSD 和RE 值。经测定MHD 血浆样品在-20 ℃冰箱中冻存30 d 后仍能保持稳定，RSD 均小于4.39%，RE 值在-2.53%～3.19%之间，结果见表3。

4 讨论

目前，有关MHD 的检测方法的文献很多，其中,高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法都有报道，后者虽有灵敏度高、专属性强的特点，但其仪器昂贵，且需专业人员进行操作，很难在大部分的医疗机构普及[13-15]。另外，国内外文献报道中多使用固液萃取法或液液萃取法进行血样的前处理，但这种处理过程相对复杂、耗时，且经济成本较高[11,16]。本方法采用甲醇沉淀蛋白进行血样的前处理，建立了HPLC 法测定人血浆中MHD 血药浓度的方法，整个过程操作简单、快速，样品分析时间较短，适用于临床大量样品的连续检测。

文献报道的流动相有乙腈-10 mmol/L 磷酸二氢钾溶液（33∶67，V/V）[12]、水-乙腈（65∶35，V/V）[17]、水-甲醇-乙腈（64∶30∶6，V/V/V）[18]等。本方法采用了水-乙腈，按不同的配比进行试验，发现当水-乙腈的比例为80∶20 时，色谱峰的峰形、出峰时间及分离度最佳。文献采用卡马西平[17]、苯巴比妥[19]和奥硝唑[20]等作为内标，本研究通过筛选发现奥硝唑的保留时间为6.1 min，不仅与MHD 的保留时间相近，又能与其有很好的分离，且其性质稳定，满足内标的要求。

本实验建立的测定人血浆中OXC 活性代谢产物MHD 的HPLC 法，MHD 线性回归方程中的r=0.998 6，说明血药浓度在2～50 μg/ml 范围内具有良好的线性关系，日内、日间精密度RSD 均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，MHD及内标的平均提取回收率在89.62%～98.76%之间。血浆样品的稳定性试验证明，在室温放置10 h、反复冻融、处理后放置进样器36 h 以及低温保存30 d 的情况下，样品未见明显降解，仍能保持稳定。本研究建立的HPLC 法操作快速简单，精密度、回收率高，稳定性好，专属性强，不受血浆中内源性物质的干扰，结果准确可靠，且灵敏度高，适用于奥卡西平临床血药浓度的监测。

目前癫痫治疗主要以药物治疗为主，奥卡西平是第二代抗癫痫药物，我国诸多癫痫病专家也建议将其作为癫痫部分性发作和全面强直阵挛发作的首选药物[21]。但奥卡西平使用过程中可能出现瘙痒、荨麻疹、血管性水肿等超敏反应，包括Stevens Johnson 综合征中毒性表皮坏死松解症[22]等，还可引起低钠血症、头晕、胃肠道不适等不良反应，有文献报道，其疗效及不良反应可能与血药浓度密切相关[23]，因此开展奥卡西平血药浓度的测定，能提高药物治疗的疗效，同时可以有效避免或减少可能产生的药物不良反应，提高癫痫患者服药的依从性。本研究建立了测定人血浆中MHD 血药浓度的方法，应用于临床，为临床个体化给药提供依据，值得临床推广使用。