烟草黑胫病生防菌LG-3 的分离鉴定及防效研究

张幸博 ，郭小红 ，刘玉珍 ，李建华 ，王 京 ，孙晓伟 ，法鹏飞 ，危月辉

（1.河南省烟草公司许昌市公司，河南 许昌 461000；2 福建三炬生物科技股份有限公司，福建 厦门 361001；3.福建省生物肥料企业工程技术研究中心，福建 厦门 361001）

烟草是中国的主要经济作物之一，其总产量和总销量居世界首位。但由于种植方式的改变，以及农药、化肥的不合理施用，烟草的病虫危害也日益加重。烟草黑胫病是国内危害最为严重的根茎病害之一，据调查表明，中国平均每年因烟草黑胫病造成的损失达上亿元，仅次于烟草花叶病毒，严重影响了烟农的经济收入［1］。

烟草黑胫病主要由烟草疫霉菌引起，在苗床期或移栽种植期均有可能发生，发病率一般在15%左右，严重可达75%，甚至造成绝收，严重影响烟草的产量和品质，给烟草产业造成较大的影响。烟草疫霉对烟草的侵染部位一般出现在茎部、根部和叶片，高温、高湿条件下更易促使该病的发生［1，2］。

现阶段，防治烟草黑胫病的方法有物理法、化学法和生物法，其中，化学防治方法效果最明显，应用较为广泛，但在化学防治病害的同时，也造成了一系列土壤污染、作物农药残留、病原菌产生抗药性等问题［3，4］。物理法耗时耗力，操作繁琐，因此，采用有效、温和的生物防治手段尤为重要。目前，生物防治的相关生防菌有芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、木霉菌属、链霉菌属等［5-9］。本研究从烟草黑胫病重病区河南省许昌市采集土壤样本，筛选分离出1 株新型黑胫病菌拮抗菌，并开展盆栽防效试验，以期为烟草黑胫病生物防治方面的进一步探究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 供试烟草为中烟100。烟草黑胫病致病菌有尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）W1G-2、烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）YM 致病菌，筛选于许昌市烟草病株。供试土壤为许昌市烟草土壤。

1.1.2 供试培养基

1）牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂15 g，加无菌水1 000 mL，pH 7.2～7.4；

2）PDA 培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂15～20 g，加无菌水1 000 mL，pH 7.0；

3）高氏1 号培养基（培养放线菌）：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂 20 g，加无菌水 1 000 mL，pH 7.4～7.6。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分离 称取健康烟株根际土壤10 g，置于250 mL 锥形瓶中，随后加入100 mL 无菌水，将锥形瓶置于220 r∕min 的振荡器上振荡5 min；配制成10-1～10-6稀释度的根际土壤悬液；分别吸取100 μL 10-4～10-6不同稀释度的土壤悬浮液，均匀涂布于培养基平板上，每个稀释度设置2～3 个平行，而后置于28 ℃恒温培养箱中培养2～7 d。待菌落长出，挑取单一的菌落移入相应的培养基进行纯化，并进行菌落形态描述，挑取单菌落，制作切片，镜检，拍照，最后将纯化后的单一菌株转接到PDA 试管斜面上，置于 4 ℃冰箱中保存［10］。

1.2.2 拮抗菌的筛选 采用平板对峙法进行测定。将拮抗菌株活化后涂布接种在平板上培养24 h，在无菌条件下用已灭菌的直径6 mm 打孔器制成菌碟，然后接种到PDA 固体培养基的四周；用已灭菌的直径6 mm 打孔器将病原菌制成菌碟接种于PDA 培养基平板中间，以只接病原菌菌碟的处理为对照。28 ℃恒温培养，待对照长满全平板时，观查对峙培养结果，待抑菌圈不再变化时，记录抑菌圈的大小并计算抑菌率，根据两菌落发展速度、菌落之间有无抑菌圈、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的拮抗菌对病原菌有无拮抗作用，每处理3 次重复。

抑菌率=［（对照组菌落直径-处理组菌落直径）∕对照组菌落直径］×100%

1.2.3 拮抗菌防效试验 试验于福建省漳州市南靖县福建三炬生物股份有限公司玻璃实验室大棚内进行，选择健壮、长势一致的烟苗，移栽到花盆中。对照（CK）取20 mL 105CFU∕mL 病原菌菌液施入花盆，24 h 后移栽烟苗，同时加入20 mL 无菌水于根部。移栽后7 d 再加1 次无菌水。处理取20 mL 105CFU∕mL 病原菌菌液施入花盆中，24 h 后移栽烟苗，同时加入20 mL 108CFU∕mL 拮抗菌菌液于根部，移栽后7 d 再加1 次拮抗菌菌液。将4 个拮抗菌株与2 株病原菌进行拮抗比较，每处理10 株烟苗，设3 次重复。

移栽后15 d 观察烟株的发病情况，烟草黑胫病致病分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准（YC∕T 39—1996）。

相对防效=（FCK-F）t∕FCK×100%，其中，FCK表示空白组病情指数；Ft表示处理组病情指数。

1.2.4 拮抗菌的鉴定 将纯化后的拮抗菌斜面送至国家农业农村部进行菌种鉴定，并由农业农村部送至指定单位进行毒理检测。

2 结果与分析

2.1 烟草黑胫病拮抗菌分离、筛选

采用3 种培养基对烟草植株体及根际土壤菌株进行分离，挑取分离平板上的单菌落进行多次划线纯化，直至分离出单菌落，记录单菌落的形态特征、编号、斜面，保存。最终从采集的烟草土壤样品中共分离得到 35 株菌株，包括 29 株细菌、4 株真菌、2 株放线菌。结果表明，烟草根际土壤中分布有大量的微生物，以细菌最多，真菌次之，放线菌最少。

将筛选的菌株进行液态培养，取发酵液进行病原菌拮抗试验，其中，有4 株菌株对供试病原菌均有明显的抑制作用，将4 个拮抗菌株与2 株病原菌进行拮抗比较，每处理10 株烟苗，设3 次重复。试验设计如表1 所示。

表1 拮抗防效盆栽处理设计

LG-12、LG-3、LT-10、LJ-11 对 2 种黑胫病病原菌表现出较好的抑菌效果（表2、图1A、图1B），其中，对烟草黑胫病抑菌效果最好的为LG-3，抑菌圈直径分别达39、28 mm，与其他3 种分离菌株之间差异达极显著水平。

表2 分离菌株对烟草黑胫病病原菌生长的抑制

图1 LG-3 对烟草黑胫病病原菌的抑菌效果

2.2 拮抗菌对烟草黑胫病的防效

以添加清水作为对照，通过在苗期人为添加病菌 W1G-2、YM 和拮抗菌，15 d 后观察烟苗生长情况。接种病菌W1G-2、YM 后，烟苗茎部发黑，无新叶生长。由表3 可知，接种烟草节杆菌（Arthrobacter nicotianae）LG-3 对烟草黑胫病的防治效果最好，相对防效达85.59%，其他拮抗菌防效相对较低。

表3 烟草节杆菌对烟草黑胫病的防效情况

2.3 菌种鉴定及菌种安全性

将对烟草黑胫病抑菌效果较好的LG-3 菌株纯化后送至农业农村部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心进行菌种鉴定，结果表明，LG-3菌株的16S rDNA 序列和RecA基因序列与烟草节杆菌的序列同源性为99%。在营养肉汤培养基上，24 h菌落圆形，微隆起，边缘整齐，表面湿润，呈淡黄色（图2A）。该菌为革兰氏阳性菌，细胞幼龄杆状，老龄断裂呈小球状，有明显的杆、球周期变化（图2B）。

烟草节杆菌在烟草上乃至农业上的应用鲜见报道，为1 株新型烟草黑胫病拮抗菌株。为后续能在烟草病害防治或农业生防方面加以应用，本研究参考微生物肥料生物安全通用技术准则（NY 1109—2006），将烟草节杆菌LG-3 送至汇智泰康生物技术（北京）有限公司进行急性经口毒性试验，结果表明，雌性、雄性小鼠经口半致死量（LD50）均大于10 g∕kg BW，属实际无毒。

图2 烟草节杆菌LG-3 的菌落形态及镜检结果

3 小结与讨论

烟草黑胫病现阶段仍以化学防治为主，主要施用抗菌剂，但长期施用化学制剂容易造成土壤污染、农药残留和环境污染，给人体健康和生态环境造成威胁。生物防治是符合健康、安全、环保可持续发展的手段。微生物对植物病原菌生长的抑制作用机制主要有代谢产物含抗菌物质、寄生于病原菌、与病原菌竞争营养和空间、或诱导植物产生系统抗病性等［11-14］。目前，对于烟草黑胫病的生物防效已有许多报道。喻会平等［15］筛选的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和恶臭假单胞菌单独使用的防效和组合菌的防效分别达60%和70%以上；Han 等［16］筛选的枯草芽孢杆菌Tpb 55 在盆栽和大田试验的防效分别为70.66%和59.34%；彭阁等［17］从烟草病株中筛选出5 株对烟草黑胫病具有较好抑制效果的真菌，其中，里氏木霉、烟曲霉和黑曲霉的防效分别为59.50%、61.82%和85.00%；黄大跃［18］从土壤中筛选出1 株对烟草疫霉抑制作用最好的链霉菌F-7，抑菌率达75.00%，但在盆栽生防试验的效果不明显，不能起到控制病情的作用；曹明慧等［19］从健康烟株的根际土壤中分离出1 株多粘类芽孢杆菌C-5，烟草苗期的防效达80%。

本研究首次从烟草根际土壤中筛选出1 株烟草节杆菌，对其进行毒理试验和防效试验，结果表明，该菌在烟草苗期表现出较好的生防效果和促生长作用，对黑胫病防效达85.59%；除此之外，有研究报道烟草节杆菌对五氯硝基苯杀菌剂具有降解作用［20］。说明烟草节杆菌在烟草病害和农药残留降解中都具有良好的研究和开发前景。经口毒性试验为实际无毒，属于安全、高效的生防菌株。但其防治机理尚待进一步研究。