熊果苷合成酶固定化条件研究

李 皓，盛希群，刘 静，钟 星

（湖北大学知行学院生物与化学工程学院，武汉 430011）

熊果苷最初是从熊果叶子中提取出来的一种糖苷类化合物［1］，其学名为4-羟基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷［2］。随着研究的深入，在多种植物中均发现有熊果苷的存在。

起初作为药用价值时，发现其具有止咳［3］和平喘的功效［4］。随着现代科学的发展，人们发现其还具有抗氧化作用［5］和美白效果。

熊果苷能够在不具备黑素细胞毒性的浓度范围内抑制黑色素细胞中酪氨酸酶，阻断多巴以及多巴醌的合成，从而抑制黑色素的生成，达到增白皮肤的效果［6］。它通过将自身与酪氨酸酶直接结合来竞争多巴的结合位点，并加速皮肤下黑色素的分解和排出，从而在一定程度上能减少皮肤中色素的沉积［7］。而α-熊果苷的美白作用优于β-熊果苷十几倍，并且不会抑制人体内的细胞生长，无副作用。同时α-熊果苷与β-熊果苷相比也更加稳定，具有更高的耐热性［8］。熊果苷的生产方法已经发展出多种方式，熊果苷也成为美白产品中必不可少的添加物［9，10］。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂购自国药集团和生工生物工程（上海）股份有限公司，菌株和载体为湖北大学知行学院生物与化学工程学院实验室保存。

1.2 熊果苷酶法生成

在工业菌株诱导后，产生的转葡萄糖苷酶能将对苯二酚和麦芽糖按照2∶1 的摩尔比反应生成单一产物α-熊果苷，化学反应式如图1 所示。

图1 对苯二酚与麦芽糖经转葡萄糖苷酶合成α-熊果苷

1.2 海藻酸钠固定化

①称取一定量海草酸钠加热搅拌溶解于去离子水中；②称取一定量氯化钙溶解于冰置去离子水中；③将冷却后的海藻酸钠胶体与一定量酶液用磁力搅拌器均匀混合，获取一定浓度的胶体；④利用恒流泵维持一个适当的流速，并将出液口绑定在一个合适的高度；⑤利用海藻酸钠胶体滴定冰置后的氯化钙溶液，获得固定化珠；⑥待固定化珠凝固，取出并用去离子水冲洗；⑦将冲洗后的固定化珠放置于滤纸上，冷藏于-20 ℃冰箱进行钙化处理；⑧钙化操作结束后，将固定化珠放入戊二醛溶液进行交联处理；⑨用去离子水冲洗，置于培养皿内，低温保藏。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌诱导表达及提取

进行IPTG 诱导剂处理，当摇床培养完成后，检测其OD，检测结果为0.583，符合IPTG 添加标准。保留5 mL 原始菌液，其余10 mL 菌液按照1‰比例加入10 μL IPTG 诱导剂混合均匀，置于摇床以37 ℃恒温和 225 r∕min 振荡培养 6 h。

取出诱导完成的菌液，进行超声波细胞破碎处理，设定功率为80 W，占空比为50%，破碎时间3 min。后期大批量处理时使用大号离心管，每次破碎8 mL，功率为100 W，占空比50%，破碎8 min。经检测，重组酶已成功表达。

2.2 固定化试验结果

以3.0%海藻酸钠滴定300 g∕L 氯化钙溶液所制成的固定化珠为例，选取其某批次固定化珠中滴定效果较好的15 颗固定化珠，放置成一排。总长度约为5.3 cm，其单个固定化珠的平均直径约为3.53 mm。再将这些珠子用电子天平称重，得到0.376 7 g的总重量，以此得出单颗固定化珠的重量约为0.025 1 g。并进行多批次滴定固定化珠，将各组固定化珠数据进行汇总，至少以3 组以上的平行数据为依据，进行固定化珠大小及重量的统计。

经过初期试验，海藻酸钠的溶解上限约为4.25%，因此设定多个海藻酸钠胶体浓度梯度（2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%），将海藻酸钠胶体和氯化钙溶液置于4 ℃冰箱冰置，利用恒流泵滴定400 g∕L 氯化钙溶液，固定化反应30 min 后将固定化珠置于-20 ℃下进行1 h 钙化操作，并且不交联。记录各组固定化珠的数据，并统计其制作消耗。由表1 可知，每毫升胶体固定化后的重量约为0.332 g，并以此为标准，称取0.332 g 固定化珠作为1 mL 酶液参与酶活检测试验，之后用1 mL 去离子水洗涤固定化珠加入体系。

表1 各浓度海藻酸钠胶体固定化珠数据

对各组固定化珠进行最适条件与耐性条件下的双重检测，并将吸收峰面积换算为生成物浓度。由图1 可知，用3.0%浓度的海藻酸钠胶体滴定400 g∕L氯化钙溶液，固定化效果最好，因此选取3.0%的海藻酸钠胶体进行进一步研究。

图2 海藻酸钠浓度对固定化酶活性的影响

已知氯化钙溶液浓度决定固定化效率，且氯化钙的溶解上限约为600 g∕L，但氯化钙溶液过高会使固定化反应过于剧烈。以3.0%海藻酸钠胶体滴定不同浓度（600、500、400、300、200 g∕L）的氯化钙溶液，将海藻酸钠胶体和氯化钙溶液置于4 ℃冰箱，固定化反应30 min 后将固定化珠置于-20 ℃进行1 h钙化操作，且不交联。记录各组固定化珠的数据，并统计其制作消耗。由表2 可知，随着氯化钙浓度的增加，得到的固定化珠平均质量和直径也逐渐增加。

对各组固定化珠进行最适条件与耐性条件下的双重检测，并将吸收峰面积换算为生成物浓度，检测结果见图3。由图3 可知，在海藻酸钠胶体浓度为3.0%、氯化钙溶液浓度为300 g∕L时，固定化效果最佳。

表2 各浓度氯化钙溶液固定化珠数据

图3 氯化钙浓度对固定化酶活性的影响

在此基础上，添加明胶作为辅助成分。经初期测定，明胶的溶解上限约为25%，但当明胶浓度超过5%时，混合胶体无法成功固定化，因此设定明胶梯度为0、1.0%、2.0%、3.0%、4.0% 和5.0%，将海藻酸钠-明胶混合胶体和氯化钙溶液置于4 ℃冰箱冰置，固定化反应30 min 后将固定化珠置于-20 ℃条件下进行1 h 钙化操作，且不交联。记录各组固定化珠的数据，并统计其制作消耗，滴定效果见表3。由表3可知，随着明胶浓度的增加，得到的固定化珠的平均质量和直径也逐渐增加。

表3 各浓度明胶胶体固定化珠数据

对各组固定化珠进行最适条件与耐性条件下的双重检测，并将吸收峰面积换算为生成物浓度，检测结果见图4。由图4 可知，在3.0%海藻酸钠胶体和300 g∕L 氯化钙溶液的基础上，辅助加入低含量的明胶可提升固定化效果。其中，明胶浓度为3%时的固定化效果最佳。

2.3 固定化时间

图4 明胶浓度对固定化酶活性的影响

在以固定化成分为3.0%海藻酸钠与3.0%明胶冰置混合胶体滴定300 g∕L 浓度冰置氯化钙溶液的基础上，设定固定化时间梯度为10、20、30、40、50、60 min，在室温条件下进行固定化时间探究试验。对各组固定化珠进行最适条件与耐性条件下的双重检测，并将吸收峰面积换算为酶活力值，检测结果见图5。由图5 可知，在由3.0%海藻酸钠和3.0%明胶混合胶体滴定300 g∕L 氯化钙溶液的条件下制成的固定化珠，其固定化反应的最佳时长为20 min。

图5 固定化时间对固定化酶活性的影响

2.4 固定化钙化时间

在以固定化成分为3.0%海藻酸钠与3.0%明胶冰置混合胶体滴定300 g∕L 浓度冰置氯化钙溶液的基础上，设定钙化时间梯度为 10、20、30、40、50、60 min，在-20 ℃条件下进行钙化试验。对各组固定化珠进行最适条件和抗性条件下的双重检测，并将吸光度换算为酶活力，检测结果见图6。由图6 可知，在由3.0%浓度海藻酸钠和3.0%明胶混合胶体滴定300 g∕L 氯化钙溶液的条件下固定化20 min 制成的固定化珠，其钙化操作时间的最佳时长为50 min。

图6 钙化时间对固定化酶活性的影响

2.5 固定化交联效果

以固定化成分3.0%海藻酸钠与3.0%明胶冰置混合胶体滴定300 g∕L 冰置氯化钙溶液，固定化20 min，并钙化50 min，在此基础上，设定戊二醛交联浓度梯度为1%、2%、3%、4%、5%，在室温下进行戊二醛交联试验，将固定化珠浸泡于相应浓度的戊二醛溶液中，暂定交联时间为1 h。对各组固定化珠进行最适条件与耐性条件下的双重检测，并将吸收峰面积换算为生成物浓度，检测结果见图7。由图7 可以看出，在由3.0%海藻酸钠和3.0%明胶混合胶体滴定300 g∕L 氯化钙溶液的条件下固定化20 min 制成的固定化珠钙化50 min 后，在多个浓度梯度的戊二醛交联剂中，保持最佳固定化效果的浓度为1%。

图7 交联浓度对固定化酶活性的影响

在1%戊二醛交联剂浓度的基础上，设定交联时间梯度为0、20、30、40、50、60 min，在室温下进行戊二醛交联试验。对各组固定化珠进行最适条件与耐性条件下的双重检测，并将吸收峰面积换算为生成物浓度（图8）。随着交联时间的增加，固定化珠的强度逐渐增加，但是固定化酶的酶活性和耐受性逐渐下降，综合考虑，交联时间固定为20 min。

图8 交联时间对固定化酶活性的影响

2.6 固定化缓冲液探究

以固定化成分为3.0%海藻酸钠与3.0%明胶冰置混合胶体滴定冰置300 g∕L 氯化钙溶液，固定化20 min，并钙化50 min，在此基础上，设定磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸氢二钠-柠檬酸和磷酸二氢钾-氢氧化钠等多个pH 为7.0 的缓冲液类型组，替换胶体溶解溶液，制作各组缓冲液类型的固定化珠。对各组固定化珠进行最适条件与耐性条件下的双重检测，并将吸收峰面积换算为生成物浓度，检测结果见图9。由图9 可以看出，在由3.0%海藻酸钠和3.0%明胶混合胶体滴定300 g∕L 氯化钙溶液的条件下固定化20 min 制成的固定化珠效果较好，在此基础上，将胶体溶解液由去离子水改为pH 为7 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液后，固定化效果得到提升。

图9 缓冲溶液类型对固定化酶活性的影响

2.7 固定化缓冲液pH 探究

在以固定化成分为3.0%海藻酸钠与3.0%明胶冰置混合胶体滴定冰置的300 g∕L 氯化钙溶液，固定化20 min，并钙化50 min，在此基础上，选取磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为对象，将海藻酸钠和明胶颗粒溶解其中，设定缓冲液pH 梯度为6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0，在室温条件下进行缓冲液pH 试验。滴定效果见表4。由表4 可以看出，在由3.0%海藻酸钠和3.0%明胶溶于磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的混合胶体滴定300 g∕L 氯化钙溶液的条件下，在多个pH 梯度试验中，仅在pH 为7 时固定化成功。

表4 pH 对固定化珠滴定效果的影响

2.8 固定化酶与游离态酶活性对比

在确定了最佳固定化条件以及其最佳保存条件的基础上，设计对固定化酶实际效果的探究试验，通过对-20 ℃冻存粗提酶液以及固定化珠，再用40 ℃解冻，并进行酶活检测，在-20 ℃冻存酶液和固定化珠，以30 min 作为每次再冻存的时间标准，在最适条件下反复检测其酶活，观察酶活损失情况，以探究固定化珠的实际运用效果。将吸收峰面积换算为酶活存活率，检测结果见图10。由图10 可以看出，反应6次时，游离态酶已完全失活，而固定化酶仍保留有较高活性，表明在由3.0%海藻酸钠和3.0%明胶溶解于pH 为7 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液所制成的混合胶体滴定300 g∕L 氯化钙溶液的条件下固定化20 min 并钙化操作50 min 所制成的固定化珠与未固定化的酶液相比，具有明显的保护作用。

图10 固定化酶与游离态酶活性的对比

3 小结与讨论

在本研究中，将转化至Escherichia coliBL21 Gold（DE3）中的aglA基因的质粒表达葡萄糖苷酶用以催化生产α-熊果苷。再利用超声波破碎技术和镍离子层析柱提取并纯化转葡萄糖苷酶，并将其采用海藻酸钠-明胶混合固定，使其可重复使用。该方法有很好的应用前景，为工业化制备奠定了良好的基础。