不同浓度6-BA 对变异株云烟97 继代培养的影响

张丽琼，陈 迪，杨松杰，聂祥涛

（安康学院现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000）

烟草作为经济作物，一直是植物生物工程学、植物分子遗传学的主要研究对象［1］，在遗传学与生物工程学的各领域中，烟草的离体培养也可以为其他植物组织培养提供参考资料。研究者在烟草茎切断和髓培养研究中，确定了嘌呤∕IAA 的比例是控制根和芽形成的条件［2］。詹红等［3］研究了 6-BA 和 NAA不同浓度对烟草植物组织的影响，经过试验证明，在MS+6-BA 0.5 mg∕L+NAA 0.5 mg∕L 培养基上，烟草的出芽率最高，但是在高浓度NAA 下对芽的生长有影响。何余勇等［4］以不同生长调节剂浓度配比处理云烟97 变异株，优化该变异株培育的快繁体系，观察结果显示，MS+6-BA 2.0 mg∕L+NAA 0.2 mg∕L 是诱导愈伤组织和不定芽分化的最佳培养基，1∕2MS+6-BA 0.1 mg∕L+IBA 0.5 mg∕L 是诱导生根的最佳培养基。何川生等［1］利用K326、红大、G-28 种子为材料，对烟草的快速繁殖进行了研究，试验结果表明，MS+6-BA 0.3 mg∕L+IBA 0.05 mg∕L 是最适宜这 3 种外植体诱导芽分化的培养基。MS+6-BA 3.0 mg∕L+IBA 0.2 mg∕L 是继代培养中的最适培养基，培养 1 个月左右后均有幼芽形成，继续培养1 个月后可以长出根。

陕西省安康市镇坪县从2010 年开始种植烤烟，种植面积稳定在200 hm2左右，属于当地的特色经济作物，为增加农民收入和财政税收作出了一定贡献。2016 年全县共种植烤烟186.67 hm2，签订种植合同108 份，共收购烟叶350 t，收购总资金798.76 万元，户均收入7.4 万元。2016 年9 月在镇坪县引进种植的云烟97 中发现2 株超高未现蕾的巨型变异株，全株无病虫害，烟叶烤后呈柠檬黄色，组织疏松、光泽鲜亮、油分充足、质量上乘。通过与普通对照株比较，发现其有较大的生长优势，株高3.4 m，茎围17.5 cm，叶片数129 片，平均 1～3 d 萌发 1 片新叶，而未变异云烟97 对照株株高仅115.3 cm，有效叶片20 片左右，节距 5.7 cm，茎围 9.7 cm，每 5 d 左右萌发 1 片新叶。

烟草组织培养适宜培养基研究的较多，但不一定适宜于云烟97 变异株腋芽的组培快繁，因此有必要探索适于云烟97 变异株快繁的培养基。为保存这一优良的种质资源，本研究利用组织培养快速繁殖的方法，以MS 为基础培养基，研究不同浓度6-BA对云烟97 变异株初代培养组培苗继代培养的影响，以期利用该变异株腋芽进行快速繁殖，通过组织培养技术获得大量无菌苗，培育出遗传稳定的云烟97变异株，研究出的快速繁殖技术可用于生产，为大面积推广种植云烟97 变异株提供种苗，对镇坪县烤烟生产的发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用烟草为2016 年9 月在陕西镇平县田间发现的2 株超高未现蕾的巨型变异株云烟97 腋芽初代培养的组培苗。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 将变异株云烟97 腋芽初代培养的组培苗切成1 cm×1 cm 左右小块，放置在添加了不同浓度 6-BA（1.0、2.0 mg∕L）的 MS 固体培养基内进行二代培养，分别用A、B 来表示，以不添加6-BA的MS 固体培养基为对照，每瓶接种5 个外植体，每种处理30 个重复，在（25±2）℃，2 000 lx，每天14 h光照条件下培养。将二代培养中生成的愈伤组织转移到含有不同植物生长调节剂组合的MS 固体培养基内（表1），基本培养基配方为：MS+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH 为5.8。愈伤组织切成1 cm×1 cm 左右小块，每瓶接种4～5 个愈伤组织，每种处理30 个重复，在（25±2）℃，2 000 lx，每天14 h 光照条件下培养。

表1 三代培养基

1.2.2 数据分析 记录每组烟草愈伤组织的生长情况和芽的发生率，并用Excel软件处理试验数据。其中，愈伤组织形成率=形成愈伤组织数∕接种外植体数×100%，出芽率=形成芽的愈伤组织块数∕接种愈伤组织块数×100%，污染率=污染的外植体数∕总外植体数×100%，褐变率=褐变的外植体数∕总外植体数×100%。

2 结果与分析

2.1 二代培养的结果分析

2.1.1 二代培养观察结果 接种后对第5 天到第25天烟草变异株二代培养的变化进行观察，结果（表2）表明，第10 天时3 个处理中外植体均开始增大，并出现愈伤组织，在第15 天时处理B 首先出现芽，处理CK 与处理A 在第25 天时有芽的形成；培养到第25 天，在 CK 处理中，共有 10 瓶出现污染，6 瓶出现褐变；在A 处理中，共有3 瓶部分出现污染，6 瓶出现褐变；在B 处理中，共有4 瓶出现污染，4 瓶部分出现褐变。经过比较3 个处理的长势、污染、褐变情况，可以看出处理B 较为适宜作二代培养基。

表2 二代培养观察结果

2.1.2 不同植物生长调节剂含量对愈伤组织形成的影响 分析不同植物生长调节剂含量对烟草变异株愈伤组织形成的影响，由表3 可知，处理CK 的褐变率与污染率均为3 个处理中最高，愈伤组织形成率最低；处理A 的污染率最低，为11.7%，处理B 次之；处理B 的褐变率最低，为13.3%，处理A 次之；处理B的愈伤组织形成率最高，为88.3%，处理A 次之。随着6-BA 浓度的升高，烟草变异株愈伤组织形成率呈上升趋势，通过综合比较，处理A 与处理B 虽然在污染率与褐变率上相差较小，但处理B 形成的愈伤组织数及总体长势更好（图1），因此，在二代培养中，愈伤组织形成率随6-BA 浓度升高呈上升趋势，且MS+2.0 mg∕L 6-BA 培养基更适合诱导该变异株愈伤组织的形成。

表3 不同植物生长调节剂含量对愈伤组织形成的影响

图1 处理A 和处理B 愈伤组织的形成比较

2.2 三代培养的结果

2.2.1 三代培养观察结果 在二代培养的基础上，选择合适的愈伤组织作为继代培养的外植体，转移到含有不同植物生长调节剂组合的MS 固体培养基内进行继代培养，定期进行观察。

第5 天时，所有处理中愈伤组织均无明显变化（表 4）；第10 天时，处理A3、A5 首先有嫩芽形成，处理A6、A7 出现芽点；第15 天时，各处理中均形成嫩芽或芽点，其中处理A5 的长势最好；第25 天时，各处理中有丛生芽出现，处理A5 的茎增高，处理A2、A3 有根出现；到第 25 天，A1 处理共有 5 瓶出现污染，4 瓶出现褐变；在A2 处理中，共有4 瓶出现污染，3 瓶出现褐变；在 A3 处理中，共有 3 瓶出现污染，1 瓶出现褐变；在A4 处理中，共有5 瓶出现部分污染，4瓶出现褐变；在A5 处理中，共有2 瓶出现污染，无褐变；在A6 处理中，共有3 瓶出现污染，1 瓶出现部分褐变；在A7 处理中，共有2 瓶出现污染，2 瓶出现部分褐变；在A8 处理中，共有3 瓶出现污染，4 瓶出现褐变；在A9 处理中，3 瓶出现污染，4 瓶出现部分褐变；在 A10 处理中，4 瓶出现污染，6 瓶出现褐变。

2.2.2 不同生长调节剂组合对烟草变异株愈伤组织分化芽的影响 在不含NAA 的条件下（表5），随着6-BA 浓度的升高，愈伤组织分化成芽率逐渐上升，在本试验条件下6-BA 浓度为2.0 mg∕L 时有利于促进愈伤组织芽的分化，但当6-BA 浓度升到3.0 mg∕L时，分化成芽率呈下降趋势，经比较，处理A3 的污染率与褐变率均低于其他3 个组合，且分化成芽率最高，由此说明，在单独使用 6-BA 时，MS+2.0 mg∕L 6-BA 培养基适合用于烟草变异株愈伤组织分化。

在 NAA 浓度为 0.2 mg∕L 的条件下，6-BA 浓度为1.0 mg∕L 时愈伤组织分化成芽率最高，即处理A5，而当 6-BA 浓度为 2.0 mg∕L 和 3.0 mg∕L 时，分化成芽率较低，说明当 NAA 浓度为 0.2 mg∕L 时，愈伤组织分化成芽率随着6-BA 浓度的升高逐渐降低，且在6-BA浓度为 1.0 mg∕L 时最高。

在 NAA 浓度为 0.5 mg∕L 的条件下，6-BA 浓度为1.0 mg∕L 时，分化成芽率为 62.4%，6-BA 浓度为 2.0 mg∕L 时，分化成芽率为 73.6%，在 6-BA 浓度为 3.0mg∕L 时，分化成芽率为 53.9%，说明当 NAA 浓度为0.5 mg∕L 时，6-BA 浓度为 2.0 mg∕L 对芽的分化作用较好。

表4 继代培养观察结果

表5 不同生长调节剂组合对烟草变异株愈伤组织分化芽的影响

处理 A5（NAA 浓度为 0.2 mg∕L，6-BA 浓度为1.0 mg∕L）愈伤组织分化成芽率最高，为88.9%，其污染率与褐变率在所有处理中均为最低，故此培养基适宜进行云烟97 变异株腋芽的继代培养。

3 讨论

本试验分别探讨了不同浓度6-BA 对愈伤组织诱导以及加入NAA 后6-BA 浓度对芽分化的影响，试验结果表明，变异株云烟97 在二代培养中，在A处理与B 处理中均能形成愈伤组织，在A 处理中分化率为76.7%，B 处理中分化率为88.3%，B 处理的愈伤组织分化较高，说明在二代培养中最优培养基配方为 MS+2.0 mg∕L 6-BA，这与陈刚［5］在对该变异株进行组织培养研究中得出的MS+2.0 mg∕L 6-BA 结果一致。

在三代培养中，当不使用NAA 时，随着6-BA 浓度的升高，愈伤组织分化成芽率逐渐上升，在6-BA浓度为 2.0 mg∕L 时达到最高，但当 6-BA 浓度升为3.0 mg∕L 时，分化成芽率呈下降趋势。当 NAA 浓度为0.2 mg∕L 时，愈伤组织分化成芽率随着6-BA 浓度的升高逐渐降低，且在 6-BA 浓度为 1.0 mg∕L 时最高。当 NAA 浓度为 0.5 mg∕L 时，逐渐增加 6-BA 浓度对芽分化有促进作用，但当6-BA 浓度达3.0 mg∕L时，对芽分化起抑制作用。

在各处理中，处理A5 愈伤组织分化成芽率达到最高，为88.9%，污染率、褐变率均较低，因此在继代培养中，更适合该变异株愈伤组织分化成芽的培养基组合是 MS+0.2 mg∕L NAA+1.0 mg∕L 6-BA，这与陈刚［5］的研究结果一致。何余勇等［4］得出 MS+2.0 mg∕L 6-BA+0.2 mg∕L NAA 是诱导愈伤组织和不定芽分化的最佳培养基，这与本研究结果不一致，原因可能是试验采用的材料及培养条件不同导致的。

4 小结

以云烟97 变异株腋芽为外植体，在25 ℃、2 000 lx、每天14 h 光照的条件下，二代培养时愈伤组织形成率随6-BA 浓度的升高呈上升趋势，最适培养基为MS+2.0 mg∕L 6-BA。三代培养基不使用NAA 时，随着6-BA 浓度的升高，愈伤组织分化成芽率逐渐上升，在 6-BA 浓度为 2.0 mg∕L 时较高，但当 6-BA 浓度升高为3.0 mg∕L 时，分化成芽率有所下降。当NAA 浓度为 0.2 mg∕L 时，愈伤组织分化成芽率随着6-BA 浓度的升高逐渐降低，且在6-BA 浓度为1.0 mg∕L 时最高。当 NAA 浓度为 0.5 mg∕L 时，逐渐增加6-BA 浓度对芽分化有促进作用，但当6-BA 浓度达3.0 mg∕L 时，对芽分化起抑制作用。通过比较愈伤组织分化成芽率，三代培养最适培养基为MS+0.2 mg∕L NAA+1.0 mg∕L 6-BA。