网络药理学方法研究三七治疗关节炎的作用机制

韩 倩，陈 勇，王竟静，魏江存，黄周艳，陈良妮

（1.广西中医药大学科学实验中心∕药学院，南宁 530200；2.广西国际壮医医院，南宁 530201）

中药三七为五加科植物三七［Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen］的干燥根和根茎，具有散瘀止血，消肿定痛的功效，主要用于治疗出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛等病症［1］，三七含有黄酮类、挥发油、多糖、皂苷类化合物。三七的黄酮类成分大部分以黄酮类醇的形式存在，从三七中分离到槲皮素、槲皮素苷、山柰酚、山奈酸以及山柰酚-3-O-β-D-半乳糖（2→1）葡萄糖苷等化合物。三七的黄酮类成分在茎叶、花蕾中含量稍微比根茎中高，为节约药物资源，三七黄酮仅作为辅助开发。在主根中的挥发油类化合物有γ-依兰油烯和莎草烯，而花中的挥发油含量最高，如β-榄香烯，可能对癌细胞也有抑制作用。三七多糖可干预炎症反应，对白细胞活化因子有下调作用，其发酵液能够抗衰老［2-9］。研究表明，三七及其提取物成分能够抗氧化、抗炎镇痛、抗肿瘤、活血止血等。三七的主要成分对于治疗关节炎有显著作用，三七治疗血瘀型和风湿热症或兼血瘀型的关节炎效果明显，且可改善临床症状［10，11］。

通过运用网络药理学方法，探究三七主要成分治疗关节炎的相关靶点和通路具有重要的意义，以此阐述三七治疗关节炎的作用机制。网络药理学是在大数据时代的背景下产生的一种新兴技术，最早由英国学者提出，以系统生物学、多项药理学和分子生物学为基础，运用多种数据库和网络计算平台对药物、成分、靶标、通路、疾病等数据加以整合分析，最后呈现出可视化的“药物-成分-靶点-疾病”网络模型，从而能够阐明以整体性为特点的中药或中成药的物质基础和作用机制［12-14］。鉴于此，本研究运用网络药理学，构建“成分-靶点-通路”的多维网络，探究三七治疗关节炎的分子作用机制，为下一步从基因层面阐明生物学内涵提供一定的理论依据。

1 数据来源

1.1 三七主要活性成分收集及筛选

口服生物利用度（OB）是描述药物口服后经肝脏而到达体循环血液中药量占口服剂量的百分比，这也是衡量药物发挥疗效的指标，OB＞30%则可认为该药物具有较好的利用度［15，16］；药物相似性（DL）则代表了中药中的某种成分与西药的相似程度，该成分在机体内是否产生与相似西药的活性，当DL＞0.18 则认为药物相似性较高，溶解度较好［17，18］。

三七主要化学成分是运用中药系统药理学分析平台数据库（TCMSP，http：∕lsp.nwu.edu.cn∕，Version 2.3）进行收集，再以口服生物利用度（OB）＞30%和药物相似性（DL）＞0.18 为条件，最后筛得 8 个活性成分。

1.2 三七活性成分作用靶点预测

通过TCMSP 数据库进一步预测活性成分相应的靶点，其中一些成分没有查询到相应靶点，用DrugBank 数据库收集并补充相关靶点信息，删除没有靶点的化学成分 1 个，使用 UniProt 数据库（http：∕∕www.uniprot.org∕）将7 个主要活性成分的相关靶点信息进行标准化处理（以人类作为物种限定标准）。

1.3 三七治疗关节炎潜在相关基因的筛选

GeneCards 和OMIM 数据库可以提供现有的基因 信 息 ，在 GeneCards（http：∕www. genecards.org∕，Version 4.5.0）、OMIM（http：∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕omim）数据库中分别以“arthritis”进行检索，合并检索结果得到关节炎基因。取三七活性成分预测的相关靶点和关节炎相关基因的Veen 图交集部分则是三七主要活性成分治疗关节炎的作用靶点。

1.4 三七-有效活性成分-靶基因-关节炎网络的构建

把7 个三七主要有效活性成分（已排除重复和假阳性）与关节炎作用靶点，先建立关系列表，后导入Cytoscape Version 3.6.0 软件绘制三七有效活性成分-治疗关节炎的网络调控图，并分析计算各作用靶标间的连接度（Degree），该值代表某个靶标与其他靶标间的相互作用，数值越高，代表该靶标可能在三七治疗关节炎中发挥的作用越大。

1.5 蛋白互作网络（PPI）绘制与分析

将三七治疗关节炎相关靶点全部导入String 数据库（https：∕string-db.org∕，Version 10.5）后，得到蛋白互作关系图，使用R 语言对蛋白网络互作连接度进行计算，最后得到核心基因。

1.6 生物过程和重要信号通路的分析

为探究三七治疗关节炎的靶点在功能基因中的作用和信号调控通路，通过UniProt 数据库得到三七治疗关节炎靶点ID，以R 语言的Cluster Profiler 和pathway 包为工具得到基因本体（GO）和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析结果。选择P＜0.05 的GO 功能富集和KEGG 通路，在从多到少的基因数中选取前20 个，结合文献进行分析。

2 结果与分析

2.1 三七活性成分筛选

在 TCMSP 数据库中以OB＞30% 和DL＞0.18 作为筛选条件得到8 种化学成分（表1），表中还列出了细胞渗透性（Caco-2）和分子质量（MW），药物穿过肠上皮屏障与 Caco-2 有关联［16］，而 MW 在 180～500 kD，则可认为药物有良好的给药性［19］。

在8 种活性成分中，根据stigmasterol（豆甾醇）、ginsenoside rh2（人参皂苷rh2）、β-sitosterol（β-谷甾醇）、quercetin（槲皮素）的4 个指标值综合情况推测，这4 种成分的药物特性较好，可能是三七发挥药理作用的关键成分。

表1 三七中活性成分信息

2.2 三七活性成分-治疗关节炎靶点预测

三七的7 个活性成分中通过TCMSP 数据库、DrugBank 数据库得到相应靶点共163 个；利用Gene-Cards、OMIN 数据库检索得到5 536 个关节炎作用靶点，得到三七活性成分和关节炎靶点Veen 图，最后得到三七药物活性成分-关节炎相关靶点131 个（图1、表2）。

图1 药物-疾病靶点维恩图

2.3 三七-有效活性成分-靶基因-关节炎网络构建

将三七的7 个有效活性成分与其治疗关节炎相关靶点连接，运用Cytoscape Version 3.6.0 软件绘制三七-有效活性成分-靶基因-关节炎的中药网络调控图（图2）。能够在三七治疗关节炎中起比较关键的调控作用可能就是靶点连接较多的活性成分：quercetin（槲皮素）、β-sitosterol（β-谷甾醇）、stigmasterol（豆甾醇）等。图2 左边中心点表示中药三七，外围7 个是三七活性成分；右边中心表示关节炎，外围表示三七治疗关节炎潜在的131 个靶点；靶点与成分依靠边线连接；图中总共包含140 个节点。

2.4 PPI网络构建与分析

将三七治疗关节炎相关靶点全部导入String 数据库后（默认限定物种为人），得到蛋白互作关系网络（图3），图中靶标表示蛋白，边线表示靶标间的相互关联；最后使用R 语言对蛋白网络互作连接度进行计算，最后得到蛋白激酶（AKT1）、JUN 蛋白（JUN）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、RELA、白介素-6（IL-6）、CXCL-8、表皮生长因子受体（EGFR）等前30 个基因蛋白柱状图（图4）。从图4 可以看出，前7 个连接度较高的靶标可以影响多个靶标，由此可以说明，三七治疗关节炎是通过多个靶标相互作用产生复杂的转录翻译复制的过程。

2.5 生物过程和重要信号通路的分析

为探究三七治疗关节炎潜在的靶点在生物过程中和信号调控通路，以R 语言的Cluster Profiler 和pathway 包为工具进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，GO 分析得出生物过程气泡图（图5），气泡越大，基因占比大，则说明这个生物过程对治疗关节炎具有重要意义；KEGG 分析得出信号通路富集结果（图6），基因数目越多，提示该信号通路在该病中是重要的通路；选择阈值P＜0.05，共富集到134 条生物过程，152条重要信号通路，再结合文献进行分析。

2.5.1 GO 富集分析 将三七治疗关节炎潜在的131 个靶点进行GO 富集分析，发现靶点主要涉及到：蛋白质异二聚活性（protein heterodimerization activity）、DNA 结合转录激活活性，RNA 聚合酶 II 特异性（DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、近端启动子序列特异性DNA结合（proximal promoter sequence-specific DNA binding）、RNA 聚合酶Ⅱ近端启动子序列特异性DNA 结合（RNA polymerase Ⅱ proximal promoter sequencespecific DNA binding）等134 条生物过程（图5）。

2.5.2 KEGG 通路分析 通过对预测三七治疗关节炎的131 个靶点进行KEGG 分析，在对其进行显著性通路富集后，得到152 条信号通路，取前20 条通路的柱状图（图6）。最后发现，三七治疗关节炎的机制包括：糖尿病并发症AGE-RAGE 信号通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complication）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、丙型

肝炎（Hepatitis C）、甲型流感（Influenza A）等通路。在众多通路中，相关度居高的5 条，可能就是在所有通路中具有重要调控作用的信号通路，列举肿瘤坏死因子信号通路（图7），红色表示三七靶基因在TNF 信号通路上的作用部位。AKT、IL-6、IL-8、EGF、VEGF、NF-kB 这些靶基因在多条通路中均有参与并发挥作用，说明三七治疗关节炎是多靶点-多通路共同调控，从而治疗关节炎。

表2 三七潜在治疗关节炎作用靶点

图2 三七有效成分-靶点网络图

图3 三七治疗关节炎潜在作用靶点之间的互作网络

图4 三七治疗关节炎作用核心靶点

图5 潜在靶点生物学的GO 分析气泡图

图6 KEGG 通路富集分析结果

3 讨论

图7 肿瘤坏死因子信号通路

三七又名田七、三漆、滇三七等，在中国有600多年的药用历史，400 年的栽培历史［20］，是中国名贵中药之一，也是常见中成药丹七片、复方丹参滴丸等的组分之一，因其有活血止血、散瘀止痛等功效被历代医家所推崇，至今三七用于治疗心脑血管疾病、跌打损伤及出血等病症。关节炎泛指发生在关节及其周围组织，由炎症、感染或其他因素引起的炎性疾病，主要表现为肿胀、畸变等；关节炎又分为骨关节炎（OA）、类风湿性关节炎（RA）、痛风性关节炎、化脓性关节炎等。有药理研究表明，三七可能通过增加转录因子GAF 和热休克蛋白70 的表达，可以明显改善萎缩性胃炎大鼠胃黏膜状态［21］；三七总皂苷可以调节大鼠关节炎的IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的表达，从而抑制组织肿胀［22，23］；三七抑制 NF-kB 的表达改善大鼠关节滑膜炎症或抑制巨噬细胞释放炎症因子而起到治疗效果［24，25］。研究表明，在类风湿关节炎的治疗中，三七对 CCP∕AST 增殖及 IFN-γ 分泌的抑制可能发挥重要作用［26］。网络药理学通过在模型网络中，建立起成分-靶点-通路的多维互作网络，探究药物与疾病之间的关联，为后续研究提供科学依据。

本研究通过网络药理学方法检索得到三七主要活性成分8 个，通过OB、DL、细胞渗透性和MW 4 个指标综合比较，发现豆甾醇、人参皂苷rh2、β-谷甾醇、槲皮素可能是发挥药理作用的关键成分。相关研究表明，β-谷甾醇和豆甾醇可以改善DDS 引起的小鼠结肠炎［27］，β-谷甾醇还能调节巨噬细胞极化，抑制促炎因子（IL-6、IL-1β）的产生，减轻类风湿关节炎症［28］。槲皮素治疗可明显减轻RA 的典型特征，如软骨间关节损伤、炎性细胞浸润；小鼠膝关节TNF-αmRNA 表达明显降低［29］；槲皮素能降低天冬氨酸转氨酶、硫代巴比妥酸活性物质和活性氧的水平，在小鼠关节炎模型中起到抗氧化、基因保护和细胞保护作用［30］；通过抑制 NF-kB 激活，减弱炎症环境中 MMP-13、细胞凋亡［31］；能够降低 RA 破骨细胞的生成和分化，提示可治疗类风湿性关节炎［32］。由此可以说明，三七依靠多成分共同发挥作用来治疗关节炎。而人参皂苷f2、人参皂苷rh2 对于抗皮肤炎症、抗支气管炎症反应也有一定的作用［33，34］，尚未见对于关节炎的报道，可以将人参皂苷作为未来研究治疗关节炎的提示成分。与7 个活性成分相关的作用靶点163 个，筛选得到关节炎靶点5 536 个，获得三七药物活性成分-关节炎相关靶点131 个，从“三七-有效活性成分-靶基因-关节炎”的中药网络调控图中，能够看出靶点连接较多的活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇，可能就是这些成分起主要调控作用。

以R 语言为工具，进行GO 富集分析和KEGG 通路分析，最后获得了134 条生物过程和152 条重要信号通路；GO 富集分析涉及蛋白质异二聚活性、DNA结合转录激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特异性、细胞因子受体结合、近端启动子序列特异性DNA 结合、RNA 聚合酶II 近端启动子序列特异性DNA 结合等关键生物过程；KEGG 通路富集结果显示，三七相关成分靶点主要涉及生物代谢途径：糖尿病并发症AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、人巨细胞病毒感染、肿瘤坏死因子信号通路等重要信号通路。肿瘤坏死因子（TNF）是一种非常关键的信号因子，它能诱导细胞内的信号通路，参与细胞凋亡、分化等；在RA 患者的滑膜、软骨中TNF 表达异常，并影响滑膜中的各种细胞，进一步破坏关节［35-37］。TNF-α 是由激活的单核巨噬细胞分泌，能够引起局部炎症还通过激活MAPK 信号通路导致滑膜组织炎性增生、关节骨与软骨的破坏；TNF 的受体之一TNFR1 可以激活其他基因，使MAPK 通路控制软骨细胞凋亡［38］。这些通路都与炎症密切相关，从生物过程和信号通路的分析可以说明，三七是通过多种成分作用于多个靶点，并且靶点又作用于不同的生物过程和信号通路，协同发挥药效。

本研究从网络药理学的角度，研究对三七治疗关节炎的作用靶点和信号通路，网络预测了三七的7 种成分作用于关节炎的131 个靶点，涉及到发挥药效的多条生物过程和通路，也为后续研究三七治疗关节炎的生物学过程和信号通路提供了一些参考。