肾小球微小病变患者GBM厚度的定量研究

任雅丽，徐 进，程 明，周 晶，黄晨诗，柴立军

(北京大学 第一医院电镜室，北京 100034)

0 引言

肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)厚度变化对于一些临床疾病的诊断具有重要意义。例如，薄基底膜肾病是以GBM变薄为主要病理表现的疾病，临床上表现为血尿，诊断必须依靠电镜对GBM厚度进行测量；糖尿病肾病则表现为GBM弥漫均质性增厚，尤其是早期病变，GBM增厚可能是患者在组织学上的唯一特征，是确诊的关键依据。目前，与GBM厚度相关肾病的诊断标准都是参照国外的建议来执行的[1-2]。这些标准的制定是基于正常人群的GBM厚度。在临床工作中，我们经常发现，按照国际标准进行诊断时，有些患者的临床表现与形态学特征会有相当程度的不吻合，其中的原因主要是由于参考值不适合所引起。目前对于正常GBM厚度的报道不一，应用各种有病变的肾组织、利用以往他人的研究资料或者无性别和年龄匹配的GBM厚度作对照都是不妥的。国内尚无系统的研究结果可供参考。由于正常人的肾组织获取比较困难，希望能有更多的替代组织用于研究分析。既往的研究提示，肾小球微小病变(minimal change disease, MCD)可能作为替代方案之一[3]。因此，我们需要了解MCD患者的GBM厚度。为了减小年龄因素的影响，我们选择41～50岁的患者作为研究对象。

1 材料与方法

1.1 样本的选择

选择2015—2021年在北京大学第一医院住院并行肾穿刺诊断为MCD的41～50岁患者作为研究对象，所有入组样本均满足以下条件:临床上无血尿、高血压、糖尿病及遗传性肾脏病等可能影响GBM厚度的疾病，患者未经过相关药物治疗；组织免疫荧光染色全部为阴性，或仅有少量非特异性IgM沉积；光镜下肾小球形态正常或仅见系膜细胞和基质轻度节段性增生，伴或不伴肾小管和肾间质急性损伤；透射电镜下显示GBM无分层、无明显皱缩、上皮足突广泛融合。符合入组条件的样本共30例，其中男性13例，女性17例；肥胖(BMI≥28)患者5例(男性1例，女性4例)，不肥胖(BMI<28)14例(男女各7例)，余11例BMI情况不详；吸烟史(大于10年，每天超过10支)的患者9例(男性8例，女性1例)。

1.2 组织处理和摄片方法

肾穿刺新鲜标本经2.5%戊二醛固定2 h，1%锇酸后固定1 h，梯度酒精脱水后用Epon812包埋，3 μm半薄切片行甲苯胺蓝染色，每个样本选择一个结构良好的肾小球进行超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双染色后于JEOL 1230型透射电镜下进行观察。透射电镜的条件统一设定为60 kV，灯丝饱和度设为75%，在15 000倍的放大倍数下拍摄数码图像。照相时遵循等距离移动原则，对每张切片上的肾小球均拍照10～15张。

1.3 GBM截面宽度的测量方法

所摄取照片在Scandium测试系统(Olympus)下随机设置测试网格，测试线与GBM足细胞侧相交处作为测量的起始点，向与GBM垂直的方向作延长线到达内皮细胞相交处，线段的长度即该点处GBM的截面宽度。以下区域GBM不作测量：血管极、系膜区、内皮下间隙增宽处、GBM皱缩处或毛细血管腔开放不良处。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，GBM厚度用均数±标准差表示。不同性别、肥胖与否及有无吸烟史的MCD患者之间GBM厚度的差别性比较采用t检验，年龄与GBM厚度的相关性分析采用Pearson检验，所有检验均为双侧检验，采用P<0.05有显著性差异。

2 结果

随机设置的网格线与每张照片内GBM的有效交点数为1～12个，每个病例测量有效截面宽度的数量为71.93±17.81(38～114)个，测量情况如图1所示。全部30例样本GBM的平均截面宽度为314.21±42.22(256.97～393.51) nm，其中男性为360.30±47.0(256.97～452.43) nm，女性为314.21±42.22(256.97～393.51) nm，两组之间差别有显著性(P=0.009)；不同性别在该年龄段的GBM厚度与年龄增长的相关性均无显著性(P>0.05)。同时，不同性别组患者GBM平均截面宽度与其是否肥胖、是否长期吸烟之间未发现有显著性差异(P>0.05)。本研究对每一例样本各点测量值的标准差进行分析，发现不同性别患者测量值的标准差有显著性差异(P=0.009)，男性高于女性。

图1 GBM截面宽度的测量方法(TEM，×15 000)随机设置的网格线与GBM足细胞侧有5处交点，有效测量5处。

3 讨论

肾小球是血液滤过的基本结构，其中，毛细血管内皮细胞、GBM和足细胞的裂孔膜共同构成肾小球的滤过屏障，任何一项结构的改变都可能导致肾小球疾病的发生，包括GBM厚度的改变。与GBM变薄相关的常见疾病是薄基底膜肾病、Alport综合征和良性家族性血尿，GBM增厚则最常见于糖尿病肾病，且GBM厚度与肾小球滤过率、糖尿病肾病的诊断和预后相关[4-5]。判断GBM增厚或变薄与否需要与其正常厚度相比较。正常GBM厚度的研究数据主要来源于早年有限的几组国外数据[6-9]。在GBM的影响因素方面，少数研究认为与性别无关[10-11]，但是大多数研究表明，GBM厚度与性别、年龄、测量方法及组织处理等方面都相关[11-12]，其是否与种族相关目前未见报道。我国正常人群中GBM厚度的数据非常少，刘林昌等[13]的研究中主要关注了性别的差别，由于病例少、年龄跨度大，无法对不同年龄因素进行系统分析。由于不同年龄段GBM厚度不同，因此有必要缩窄年龄段进行分析。但是，实际工作中获取足够数量的正常人肾组织比较困难，如果能以现有肾穿刺患者标本库中的样本进行替代，就可以完成这些工作。已有的证据表明，经过长时间激素治疗的MCD患者的GBM增厚，但是没有证据显示未经治疗的MCD患者GBM相比正常肾组织的厚度发生变化。

Danilewicz等[3]的研究显示，MCD患者与正常人GBM厚度相比差别无显著性，提示将这类患者标本用于分析正常人GBM厚度的可能性。本研究希望了解符合入组条件的MCD患者的GBM厚度，以便后期分析是否可以将其作为正常GBM厚度的数据。在选择MCD入组病例时，我们从临床和组织病理水平排除了已知可能影响GBM厚度的相关因素，包括糖尿病、血尿、遗传性肾脏病、激素治疗等因素，测量时也剔除了可能不代表GBM正常厚度的区域，例如系膜区、血管极、内皮下间隙增宽、GBM皱缩或者开放不良处。

GBM测量最常用的方法是正交截距法，由Jensen等[14]最早于1979年发表，他们建议将该方法用于GBM测量。简言之，就是在显微照片上放置等距离相交线的网格，在网格上的一条线截取内皮细胞GBM界面的每个点上进行GBM测量。为了减小由于切面原因导致GBM厚度的不准确，Gundersen等[15]建议通过校正求出GBM的调和平均厚度来代表GBM的真正厚度。但是，计算调和平均厚度比较复杂，不适用于临床工作。因此，实际使用中直接测量GBM截面宽度更可行，如果方法使用得当，两种测量完全具有可比性[16]。为了在临床工作中便于实施和数据比对，本研究对GBM截面宽度进行测量，采用算数平均值表示GBM厚度而不计算调和平均厚度。

本研究结果显示，GBM平均截面宽度在不同性别的患者中有显著性差异(P=0.009)，男性高于女性，这与以往的大部分报道是相同的[8，13,17]。进一步证明，GBM厚度的性别差异。同时，也证明GBM平均截面宽度在41～50岁年龄段内与年龄不相关，GBM厚度相对恒定。在对患者的临床资料进行分析时发现，GBM平均截面宽度的测量值与患者是否肥胖、是否有吸烟史无关。鉴于进一步分组时总样本量偏小，且不同组别之间样本量差别大，该结果未必能代表实际情况，后续将扩大样本量进行分析，以证实相关结论。在此基础上，对每个样本的测量值进行分析，发现男性患者的测量值标准差与女性患者相比差异有显著性(P=0.009)，男性患者的变异情况更明显，也就是说同一病例中，男性患者的测量值更不均一。这其中的影响因素还有待于进一步分析。

总之，在对41～50岁未经治疗的MCD患者GBM截面宽度的分析中发现，该年龄段患者的GBM厚度恒定，且男性比女性厚。